重组鸡白细胞介素18的基因表达及其免疫原性研究

白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTMDual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上是安全的表达载体；外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。

孔娜，女，博士，讲师，毕业于山东农业大学，就职于菏泽学院。主要从事微生物学与免疫学的研究。工作以来，共主持和参与项目3项，其中省部级1项，校级2项。以独立作者发表科研论文8篇，其中SCI收录2篇。以独立作者获得菏泽市自然科学优秀学术成果奖1项(二等奖)等。指导学生团队在第五届全国“生泰尔杯”大学生动物医学专业技能比赛荣获一等奖，被评为优秀指导老师。获山东省第五届“超星杯”高校青年教师教学比赛优秀奖等。

概述()
一、白细胞介素18的研究进展（）
二、鸡IL-18的研究进展（）
三、鸡IL-18对传染性法氏囊病疫苗免疫原性提高的研究进展（）
四、鸡IL-18对禽流感免疫原性提高的研究进展（）
五、鸡IL-18在杆状病毒表达系统中表达的研究进展（）
第一章ChIL-18原核表达蛋白复性研究()
第一节不同复性方法对rChIL-18原核表达蛋白复性率和生物学活性的影响（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二节人工分子伴侣系统辅助rChIL-18原核蛋白复性过程中影响因素的研究（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二章rChIL-18原核蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究()
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第三章mChIL-18与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacTMDual中的共表达及其免疫原性研究()
第一节mChIL-18与VP2或HA1在杆状病毒表达载体中的共表达（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二节双表达产物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物学活性检测（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第三节双表达蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
研究结果()
相关文章()
参考文献()
符号说明()
附录()

前言
白细胞介素18(Interleukine-18,IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTM Dual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上安全的表达载体。外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由IBD 病毒(IBDV)感染雏鸡引起的以淋巴组织，特别是中枢免疫器官——法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制，使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的，但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2 是IBDV的主要保护性抗原，已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2 上，并且多为构象依赖性，这意味着VP2 的立体结构对其中和表位的形成至关重要，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。
禽流感(Avian influenza,AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI 的暴发给养禽业带来了一定的经济损失，H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失，还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位，故其完全可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。
本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，选用pFastBacTM Dual双表达载体，在昆虫细胞中共表达mChIL-18基因蛋白和IBDV VP2基因蛋白或H5型AIV HA1基因蛋白，并对未纯化蛋白生物学活性进行分析；进而研究未纯化蛋白免疫原性。为进一步研究VP2基因工程疫苗、HA1基因工程疫苗的免疫效果以及mChIL-18在IBD、AI的免疫调节作用等相关研究奠定基础。
一、ChIL-18原核表达蛋白复性研究
研究利用不同的复性方法辅助rChIL-18原核表达蛋白的复性，以提高鸡IL-18重组蛋白复性率，获得更多具有良好活性的蛋白。将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白彻底变性,然后利用盐酸胍-去离子水透析法、盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法和人工分子伴侣系统法分别辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后，利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性的方法获得的复性率最高，复性率为4254％。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。上述试验显示，人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性，获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。
将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白彻底变性。然后按照试验设计，考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明，利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件，优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率，且产物都具有良好的生物学活性，为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了试验基础。
二、鸡IL-18原核表达蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18（ChIL-18）的研究，先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统，在此基础上，对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测，对其在生产中的应用做了初步研究，同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。将鸡IL-18原核表达蛋白的复性产物和真核表达质粒pcDNA31TOPO-mChlL18分别与IBDV灭活疫苗联合应用，通过中和抗体检测和T淋巴细胞对ConA增殖反应试验，研究其对IBDV灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示，在接种后第21、28、35及42天时蛋白组和质粒组与单纯疫苗组抗体水平差异显著（P<005）,且蛋白组比质粒组效果更明显一些；其T淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组，尤其是在免疫14天后增殖效果明显高于单纯疫苗组（P<005）。接种42d后进行攻毒保护性试验，结果表明：同时接种鸡IL-18原核表达蛋白复性产物和真核表达质粒的试验组鸡获得933％的保护率，而单纯疫苗接种组的保护率为733％。鸡IL-18的原核表达蛋白和真核表达质粒均具有明显的增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。
三、mChIL-18与VP2或HA1在杆状病毒表达载体中的共表达
分别以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18质粒为模板，以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体，将mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别插入到载体的PH启动子和P10启动子的下游，构建重组转移载体质粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。将其转化DH10Bac感受态细胞，经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选，用小量法提取重组杆状病毒质粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1，通过一对通用引物M13(Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点，能够从两侧扩增LacZα互补区域内的mini-attTn7位点，有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定。在转染试剂Cellfectin II的作用下，通过脂质体介导法将纯化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9，sf9)获得P1代重组杆状病毒，用P1代病毒感染sf9来扩增病毒滴度，将达到一定滴度(107～108pfu/mL)的P3代重组杆状病毒感染sf9，感染72h后收获sf9细胞及培养上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和间接免疫荧光试验(IFA)检测。SDS-PAGE检测显示，mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表达，即表达的蛋白是可溶性的，表达的目的条带分子量分别约为195 KD,484 KD,374 KD。IFA检测显示mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别同时在同一细胞中独立表达。
四、双表达产物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物学活性检测
采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明，不同浓度的pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18均能够明显促进淋巴细胞的增殖，随着蛋白浓度的增加刺激转化作用逐渐增强，均当浓度为200ng/mL时，刺激转化效果最佳，增殖指数可达413、435、409，但随着蛋白浓度的增大淋巴细胞的增殖指数逐渐降低。VSV病毒活性抑制试验表明，当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ，并且随着pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18浓度的增加诱导产生IFN-γ的量随之增加；将不同稀释度的IFN-γ分别作用于VSV，在IFN-γ≥1×102U/mL时，具有较强的抑制效果，当IFN-γ为10 U/mL时，只能达到约50%的保护。该结果说明pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18的抗病毒活性是通过IFN-γ实现的，且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。
五、双表达蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究将含有pIL18、pVP2、pVP2-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物，14d时一免，28d时二免。Ⅰ组为传统疫苗组；Ⅱ组为pIL18与B78减毒疫苗联合疫苗组；Ⅲ为pIL18与pVP2联合疫苗组；Ⅳ组为pVP2-IL18单独免疫组；Ⅴ组一免注射B78减毒疫苗，二免注射pVP2-IL18；Ⅵ组为pVP2单独免疫组；Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都促进CD4 和CD8 T细胞增殖。一免后各试验组CD4 T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ呈上升趋势且持续时间比较长，其中Ⅳ组CD4 T增殖水平最高，在一免后21d、28d、35d都与其他组差异显著(P<005)。一免后各试验组CD8 T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后各实验组仍呈不同下降趋势，其中Ⅰ组CD8 T增殖水平最高，在一免后14d、21d、28d都与其他组差异显著(P<005)。体液免疫水平通过使用传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前相比，各试验组都有较好的促进IBD抗体生成作用，抗体水平都持续增高且维持时间也较长，都在在一免后28d抗体水平达到最高；与阴性对照组相比，Ⅳ组效果最好，抗体效价最高，Ⅴ组次之,然后是Ⅱ组、Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅵ组。攻毒试验结果表明，Ⅳ组保护率可达90%，Ⅴ组次之可达80%，然后是Ⅰ组和Ⅱ组75%、Ⅲ组为70%、Ⅵ组50%，Ⅶ组无一幸免。
将含有pIL18、pHA1、pHA1-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物，7d时一免，21d时二免。Ⅰ组为传统疫苗组；Ⅱ组为pIL18与传统疫苗联合疫苗组；Ⅲ为pHA1单独免疫组；Ⅳ组为pHA1-IL18单独免疫组；Ⅴ组pIL18与pHA1联合疫苗组；Ⅵ组为pHA1单独免疫组；Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都能够明显促进CD4 和CD8 T细胞的增殖反应：一免后各试验组CD4 和CD8 T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后虽呈上升趋势且持续时间比较长，但增殖幅度不大，以Ⅳ组CD4 T增殖水平最高。体液免疫水平通过使用血凝抑制试验检测。结果表明，各试验组都有较好的促进ND、H5型AI和H9型AI抗体生成作用，都是在一免后28d抗体水平达到最高；与阴性对照组相比，Ⅳ组效果最好，抗体效价最高与其他组差异显著(P<005)。

著者2019年3月

概述
一、白细胞介素18的研究进展
（一）IL-18的发现
1982年，Okmura等发现痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,Pacnes)与丝裂原LPS合用能显著增加IFN-γ的分泌水平，推测有中介因子参与，但一直未能确定。1989年，Nakamura等从痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,Pacnes)和细菌脂多糖(LPS)致内毒素休克的小鼠血清中分离出一种具有诱导产生IFN-γ活性的蛋白因子，研究发现，这种因子与IL-12有很多相同之处。1995年，Okamura等发现用Pacnes处理的小鼠再用抗CD3单克隆抗体刺激，可释放高水平的IFN-γ。随后用Pacnes接种小鼠，再用LPS诱导小鼠使其中毒休克，从其肝脏提取液中分离到一种均一多肽，约18KD。根据其中两个多肽片段的氨基酸序列合成寡核苷酸引物，以此为引物用RT-PCR将从小鼠肝脏中提取的mRNA扩增出一个不完全的cDNA片段，作为探针，筛选小鼠肝细胞cDNA文库，得到一全长的cDNA克隆，并在大肠杆菌中表达。因其可诱导IFN-γ产生，命名为γ-干扰素诱导因子(interferon gamma inducing factor,IGIF)(Okamura et al,1995)。1996年，Ushio等用鼠IGIF cDNA作为探针，从正常人肝脏cDNA文库中分离出人的IGIF cDNA。并在大肠杆菌(Ecoli)中表达，鉴于IGIF的氨基酸序列与已知数据库中的任何蛋白质均不相同，并且它除了能诱导IFN-γ产生外还有多种生物学活性，因此重新命名为白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)(Ushio et al,1996)。
（二）IL-18的分子结构
鼠IL-18(mIL-18)前体蛋白由192个氨基酸组成分子量238ku，N末端有一结构特殊的35个氨基酸组成的信号序列，无N端糖基化位点、无野生型疏水信号肽样位点。成熟mIL-18由157个氨基酸组成，分子量182ku，等电点PI = 49(Okamura et al,1995)。IL-18前体与IL-1β前体相似，没有生物学活性。但两者都有IL-1β转换酶(interleukin-1β-converting enzyme,ICE or Caspase-1)的加工位点天冬氨酸残基(Asp)，ICE可选择性地在特异性的位点切割，使之成为有活性的成熟蛋白(Ghayur,et al,1997;Gu et al,1997;Lorey et al,2004;Nagata et al,2002)。目前认为，小鼠的裂解位点是35Asp- 36Asn，人的IL-1β切割位点是36Asp-37Tyr。实验证明，ICE缺失的小鼠可以生成IL-18前体，但不能将其转换成有活性的IL-18。LPS不能在这种小鼠诱导生成IFN-γ(Fantuzzi et al,1998;Melnikov et al,2001)。另一方面，参与细胞凋亡的Caspase-3也能将IL-18前体蛋白和成熟体蛋白降解成无活性形式的降解型副产物，这也可能构成了IL-18一种潜在的负调节机制(Akita et al,1997;Ghayur et al,1997)。据报道，Proteinase-3也可以激发Pro-IL-18的生物学活性。但是，相比而言，Pro-IL-18或者成熟IL-18在76Asp-77Asn以及71Asp-72Ser之间被Caspase-3切开则产生了无活性生物肽(Sugawara et al,2001;Pirhonen et al,1999)。人白介素18(hIL-18)基因编码193个氨基酸前体蛋白，与mIL-18有65%同源性，N端也有类似的信号序列，亦无N端糖基化位点和疏水信号肽位点(Ushio et al,1996)。mIL-18和hIL-18都有IL-1类似的特征性结构(称为IL-1特征样序列)：phe-x(12)-phe-x-ser-x(6)-phe-leu。IL-18的空间结构由12股β片形成β-三叶折叠，这也与IL-1蛋白家族空间结构类似(Bazan et al,1996)。mIL-18可能定位于小鼠9号染色体糖尿病易感基因Idd2区间，推测hIL-18可能定位于IL-1β基因所在染色体2q13区间(Rothe et al,1997)。IL-12能诱导转录信号传导和激活Stat家族蛋白的Stat3、Stat4酪氨酸磷酸比，但用IL-18处理Th1细胞后Stat4酪氨酸磷酸比现象消失。这说明确切的IL-18信号传导路线尚在探索中。折叠识别分析表明，IL-18的蛋白质序列与IL-1β有19%的同源性，与IL-1α有12%的同源性。二者的空间结构是β折叠链，2个发夹结构，故整个结构共有12条反向平行的β折叠链和6个发夹结构。其中6条β折叠链、3个发夹结构形成一桶状结构，其中央是一个巨大的疏水核心，而另6条β折叠链和3个发夹结构在桶底部作三角形排列，形成一个“桶盖”。由于IL-18与IL-1有很多相似之处，两者可能来源于相同的祖先，故有人建议将IL-18命名为IL-1γ。
（三）IL-18的分布及产生
免疫或非免疫细胞都可产生IL-18，人和鼠的IL-18主要由巨噬细胞产生，如单核巨噬细胞，肝脏Kupffer细胞等。现已发现在小鼠表皮角化细胞、成骨细胞、小肠上皮细胞以及大鼠的肾上腺皮质网状带和束状带细胞均可表达IL-18。小鼠的IL-18主要由肝脏中的Kupffer细胞产生，外周血单核细胞经LPS刺激也有IL-18 mRNA的表达。现已发现在小鼠表皮角化细胞、成骨细胞、小肠上皮细胞以及大鼠的肾上腺皮质网状带和束状带细胞均可表达IL-18(Gracie et al,2003;Wheeler et al,2003)。人IL-18的细胞来源还不确定，外周血中只有单核巨噬细胞不经诱导即可表达IL-18mRNA，而T、B细胞中几乎检测不到。ConA或PHA刺激的外周血中IL-18mRNA的表达量没有明显改变，提示人IL-18可能来源于单核巨噬细胞系统(赵丽等,2006)。
机体许多器官和细胞都可以检测到IL-18 mRNA，如肝、肾、脾、胰、骨骼肌、肺、成骨细胞、皮肤的角质细胞、活化的巨噬细胞等。在生理条件下，人血液中就含有的IL-18浓度可达50～150ng/L(Taniguchi et al,1997)。鼠肾上腺皮质、垂体后叶(神经垂体)(Conti et al,1997)、肠上皮细胞等非免疫组织都有IL-18的分布和表达(Takeuchi et al,1997),提示IL-18可能作为一种神经免疫调节剂起作用。人成骨细胞、关节软骨细胞也产生IL-18，它在此可能参与骨质代谢过程。
不能肯定IL-18是否以成熟活性形式分泌，因为proIL-18没有保守的信号肽。Gu等(1997)发现用proIL-18表达质粒转染COS细胞有近10%的成熟IL-18分泌，而ProIL-18却不到1%。这可能是IL-18以成熟功能形式分泌的一种证据。但此种分泌机制不清楚。Stoll等(1998)用RT-PCR及细胞剔除的方法证明小鼠角朊细胞或其细胞系PAM212能表达IL-18 mRNA，而且发现过敏原能刺激IL-18 mRNA的表达及有活性的IL-18的产生。这一发现与表皮角朊细胞能影响T细胞向TH1/TH2偏轨相符，也与它们产生ICE相符。
（四）IL-18的生物学功能
1.IL-18促进细胞因子的分泌
IL-18可以诱导Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ，这是它最主要的一个生物学功能。IL-18通过IRAK/TRAF6信号途径，使NF-κB和AP-1在细胞核内与IFN-γ基因启动子中特定的DNA调节序列相结合，激活IFN-γ启动子，从而使IFN-γ基因表达和蛋白合成(Dinarello et al,1998;Pavlova et al,2008;Shi et al,2010) 。在抗CD3分子单克隆抗体存在下，mIL-18可显著刺激鼠Th1细胞产生IFN-γ，并且活性比IL-12高。IL-18与IL-12联合作用时产生IFN-γ比IL-18或IL-12单独作用所产生的多，二者具有协同效应。此协同作用主要是由IL-12诱导T细胞表达IL-18Rα及随后的IL-18上调IL-12Rβ2相互作用所介导的(Yoshimoto et al,1998;Chang et al,2000)。实验表明，在培养液中加入鼠IL-12中和抗体不能抑制IL-18诱导Th1细胞产生IFN-γ，提示IL-18的活性不依赖于IL-12。同样，加入IL-18中和抗体也不能抑制IL-12诱导产生IFN-γ。当IL-12的作用达到饱和时，IL-18的加入依然可以发挥作用，由此说明这两种细胞因子通过不同的信号传导途径，独自起作用。IL-18除可以诱导Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ外，有研究表明IL-18和IL-12共同作用时可使抗CD40分子抗体活化的高度纯化的鼠B细胞产生IFN-γ(Yoshimoto et al,1999)。来源于鼠骨髓的巨噬细胞在IL-12和IL-18刺激下也能产生大量的IFN-γ。由此可见，巨噬细胞不仅可以通过产生IL-12和IL-18刺激T细胞、NK细胞和B细胞产生IFN-γ，并且其自身在IL-12和IL-18作用下也产生IFN-γ。此外，IL-18还可以刺激T细胞产生IL-2(Xu et al,2008;Tang et al,2008)、GM-CSF和TNF-α，外周血单核细胞在IL-18刺激24h后，可检测到有IL-1β和IL-8的产生(Puren et al,1998)。嗜碱性粒细胞和肥大细胞在IL-3和IL-18刺激下也可产生IL-4和/或IL-13。 CD4 静息T细胞与IL-18和IL-2共同培养时，可产生大量的IL-13和少量的IL-4，若用抗CD3分子单克隆抗体刺激培养物，可增加它们产生Th2型细胞因子的能力。并且，这些活化的T细胞可极化为Th2细胞(Yoshimoto et al,1999;Nakanishi et al,2001)。由此可见，IL-18不仅在Th1反应中有重要作用，而且在Th2反应中也发挥一定作用，是一种多功能型的细胞因子。IL-18的功能还包括诱导IL-1β肿瘤坏死因子α和几种趋化因子的分泌。
2对T细胞的作用
IL-18对T细胞表达细胞因子有显著的影响。重组人IL-18(rhIL-18)对T细胞具有促增殖作用。在经CD3单克隆抗体刺激的富集T细胞中加hIL-18，T细胞增殖作用显著增强(纪丽丽等,2005)，且呈剂量依赖性，若rhIL-18浓度较低(10 ng/mL)时，这种促增殖作用可被抗IL-2抗体所抑制，IL-18能促进CD3刺激的T细胞分泌IL-2。酶联免疫吸附分析表明重组的IL-18可刺激T细胞和外周血单核细胞产生大量的IFN-γ(Greene et al,2000)，其效能超过IL-12。联合应用IL-18和IL-12可使体外培养的T细胞产生大量的IFN-γ，其效果优于任何一种因子的单独作用，说明这两种因子诱生IFN-γ的途径可能不同。 IL-18还可以显著的增加培养的T细胞的IL-2的产量，与IL-12不同的是IL-18在没有抗原或CD3刺激存在的时候也可以刺激T细胞产生IL-2，IL-18的这种刺激作用可能是通过活化NF-κB实现的。总之，IL-18促进T细胞的增殖的效应明显是通过一种IL-2依赖途径进行的(Micallef et al,1996)。对鸡脾淋巴细胞，鸡IL-18不需要IL-2的共刺激，就可以刺激T细胞增殖(Gobel et al,2003)。至于IL-18是否参与Th细胞的分化，已有结果表明IL-18不能诱导初始CD4 T细胞向Th1细胞分化，但可能通过促进IL-12来诱导向Th1细胞分化(陈湘琦等,2005)。此外，有人发现在混合淋巴细胞培养开始时即加入IL-18能增强同种异体T细胞的细胞毒性(Dinarello et al,2003)。
3对B细胞的作用
抗IL-18抗体和IL-12抗体都能抑制抗原和抗原提呈细胞(脾脏B细胞)刺激后的Th1细胞产生IFN-γ，并且两种抗体没有交叉反应性，这表明Th1细胞与抗原提呈细胞相互作用时有IL-18和IL-12的产生(内源性释放)(Kohno et al,1997)。Hoshino等(1999)发现IL-18转基因鼠体内B细胞数目减少，但IgE、IgG等含量却上升。也有实验发现IL-12能轻微抑制从脾细胞提取纯化的B细胞的分泌功能，而IL-18没有作用，当IL-18与IL-12一起刺激时可明显抑制Ig的分泌，并且可促使CD40抗体活化的B细胞分泌IFN-γ，产生的IFN-γ不抑制B细胞的增殖，但可抑制IgE、IgG1的生成，同时提高IgG2a的表达量。提示IL-18可能阻断由IgE介导的过敏反应。其机制可能是通过上调B细胞表面的IL-18R。
4增强细胞毒作用
IL-18通过细胞毒作用途径在清除病毒过程中发挥部分作用(Sekiyama et al,2005)。IL-18可上调NK及CD8 T细胞的细胞毒作用，NK与CD8 T细胞一样以多种形式、利用不同的分子发挥它们杀细胞的作用。首先是利用胞吐杀细胞物质穿孔素；第二，效应细胞上FasL的表达诱导有Fas的靶细胞凋亡；第三，TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是新近发现的与多种表达有TRAIL受体的肿瘤细胞相关的细胞毒机制。IL-18可上调穿孔素依赖的细胞毒机制和FasL的表达，但不增加TRAIL的表达，另外因IFN-γ可激活NK细胞，IL-18增强NK活性可能也通过IFN-γ介导的方式(Tsutsui et al,1997)。IL-18与IL-12在上调细胞毒方面没有协同作用。IL-18 缺乏的小鼠，其NK功能下降，给予外源性IL-18，不仅可恢复NK功能且可增强其溶细胞的活性。同时因IL-18可上调IL-18Rβ的基因表达，给予外源性IL-18还可上调IL-18R缺乏小鼠体内NK的活性。
5.IL-18的免疫调节作用
IL-18对机体的免疫反应具有双向调节作用，分为增强和减弱两方面。所谓免疫增强是指用人为措施，全面或选择性提高机体的免疫功能，以达到治疗疾病的目的。增强( enhancement)过去又称刺激( stimulation)，是刺激机体自身免疫系统，激活或调动机体的免疫功能潜能，是一种主动免疫过程。在养禽业，由于超强毒株的出现，使得活疫苗的应用受到很多人关注，要求寻找替代疫苗。然而，灭活疫苗或重组亚单位疫苗不能提供足够的保护，通常需要使用佐剂。但是油佐剂通常会诱导局部负反应，导致肉品质降低，因此在家禽上没有合适的、价廉的、高效的佐剂与抗原一起免疫鸡体。在过去的几年中，应用细胞因子、趋化因子以及共刺激分子作为DNA疫苗的分子佐剂的研究报告很多。IL-2、IL-12或 IL-18与人前列腺肿瘤疫苗合用，能使小鼠显著增强Th细胞增殖(Kim et al,2000)。将IL-18和IL-12基因融合入树突状细胞(DC)，免疫小鼠能提高IFN-γ的表达(Iinuma et al,2006)。原核表达重组鸡白细胞介素-2与鸡新城疫-禽流感-法氏囊-传支四联油乳剂灭活苗同时使用明显提高抗体效价，且无毒副作用(费聿锋等,2004;Henke et al,2006)。
细胞因子(Henke et al,2006;Ma et al,2006)质粒DNA注射后在体内相当长的时间内都会表达细胞因子，因此当细胞因子被应用于调节DNA疫苗的免疫应答时，就具有非常明显的优势。诱导Thl型应答的细胞因子与DNA疫苗结合起来，大多数的研究结果发现：IgG 1/ IgG2a的比率随着同时注射IFN-γ、IL- 2、IL-12、IL-15或IL-18编码质粒而下降，大多数的DTH应答和CTL应答也增强。DNA疫苗与编码诱导Th2型应答的细胞因子的质粒一起注射，诱导的免疫应答通常以产生高水平的IgG 1抗体为特征，导致高水平的总抗体和高IgG 1/ IgG2a抗体比率。IL-18 cDNA疫苗对小鼠自发性狼疮样病有一定效果(Bossu et al,2003)。将前列腺抗原特异性抗原PSA的DNA与鼠IL-18质粒共同免疫小鼠，使极低剂量的抗原也能获得很好的保护率(Marshall et al,2006)。将IL-12、IL-18基因与猪瘟病毒糖蛋白gp55/E2构建共表达质粒，肌肉注射3次，IL-18组能提高攻毒保护率(Wienhold et al,2005)。将AIV的HA基因与鸡IL-18基因插入痘病毒构建重组痘病毒，免疫SPF鸡和商品来航鸡，有100%的保护率(Ma et al,2006)。以鸡痘病毒282E4中国疫苗株为载体,构建了共表达中国流行株HIV-1外膜蛋白gp120和IL-18的重组鸡痘病毒,可诱导小鼠产生特异性抗体和脾特异性CTL反应(江文正等,2004)。
用His标签融合表达的鸡IL-18重组蛋白与NDV疫苗联合使用，检测抗体，IL-18作为佐剂的效果优于氢氧化铝(Degen et al,2005)。将表达pcDNA3l /ChIL-18DNA疫苗和新城疫灭活苗联合注射鸡体，结果显示用常规ND灭活疫苗与ChIL-18基因重组真核表达质粒联合注射，比只用常规ND灭活苗免疫鸡其T淋巴细胞转化功能有明显提高，单独应用ChIL-18基因重组真核表达质粒注射的鸡其T淋巴细胞转化功能也比不注射pChIL-18的明显增强(温纳相等,2005)。曹素芳等将共表达pcDNA3l/oomph-ChIL-18 DNA疫苗免疫鸡，其保护效率达到8/17，而pcDNA3l/ompH DNA疫苗和重组蛋白ompmH油乳苗保护率分别为5/17和2/17，很明显鸡IL-18能提高基因疫苗的免疫效果。由于基因疫苗的研究还处于起步阶段，尚有许多问题未能解决，远未达到在临床应用的阶段。
二、鸡IL-18的研究进展
（一）鸡IL-18的发现
2000年，Schneider等根据鸡法氏囊EST(Expressed Sequence Tag)数据库中相应的基因序列分析，设计特异性引物，从脂多糖(LPS)刺激的鸡巨噬细胞系HD-11的cDNA中首次扩增并克隆出来鸡IL-18(Chicken Interleukin-18,ChIL-18)。序列分析表明，在第29位天门冬氨酸残基处由IL-1β转换酶切割除去前导序列而成为成熟的鸡IL-18多肽，其成熟蛋白由169个氨基酸组成。将编码ChIL-18成熟蛋白的基因克隆至原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达，获得相对分子质量约为23kDa的重组融合蛋白(His-ChIL-18)。ChIL-18与哺乳动物的IL-18在氨基酸水平上约有30%的同源性。还证明，rChIL-18具有刺激鸡脾细胞产生ChIFN-γ的生物学活性，至于ChIL-18的其他生物功能还有待于进一步研究(Schneider et al,2000)。
（二）鸡IL-18的研究
2003年，刘胜旺等报道将编码鸡IL-18成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，表达的融合蛋白占菌体蛋白的30%，分子量约为23kDa。刘胜旺等用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验对多克隆抗血清进行了证明。2005年，胡敬东等通过引物设计去除ChIL-18的前导序列，直接克隆了ChIL-18成熟蛋白基因，并将其亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，经测序鉴定正确后在大肠杆菌BL21中进行表达。结果表明，该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST-ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32%，为进一步研究有关重组ChIL-18的生物学特性及其临床应用打下了基础。利用白介素-18等细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫(Degen et al,2005)，不仅能有效防控畜禽疾病，而且将在畜牧业生产中产生巨大的经济效益，是被普遍看好并具有广阔应用前景的新型佐剂(王宪文等,2008)。随着分子生物学、免疫学理论和技术的迅猛发展，学者们对白介素-18等细胞因子进行了越来越多的研究(窦永喜等,2005)，在畜禽疾病的治疗和预防上显示了广阔的前景。
（三）原核表达产物的纯化方法
大肠杆菌表达体系因其具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。包涵体易于分离纯化,只要能够在体外成功复性,将是大量生产重组蛋白最有效的途径之一。然而,重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成坚硬的、不溶的、无活性的聚集体(aggregation)、又称包涵体（inclusion body），必须经过变性、复性才能获得生物学功能。
大肠杆菌表达系统中,两方面因素可造成包涵体形成：其一,为追求较高的表达效率,在载体系统中采用强的启动子和增强子序列，靶蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的15%～50%和40%～50%（Makrides,1996）。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时,无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系,都可形成包涵体（Gribskov et al,1983）。其二,大肠杆菌细菌细胞没有与真核细胞完全适应的结构基础和折叠机制,缺乏辅助真核蛋白质折叠的分子伴侣和折叠酶。而且，对于含有二硫键的重组蛋白而言，处于还原环境的细菌胞质不能有效地完成二硫键蛋白质的氧化折叠。硫氧还蛋白还原酶活性缺失突变的大肠杆菌菌株ADA494,ADA494( DE3)等有利于二硫键在细胞质内的形成（宁云山等，2001）。当蛋白存在一个以上二硫键时,可以出现多种不同组合的构象，而其中只有一种是天然构象,生物学活性最高。组合数目随着蛋白二硫键数目的增加，而呈几何级数增长,因此,必须建立一个环境使二硫键错配能得到有效的纠正。
1包涵体的分离
包涵体是聚集的蛋白质形成的非常致密的颗粒,它们可直接用反相显微镜在活细胞中观察到（刘国诠，2003）。包涵体直径可达μｍ级,并呈现出无规则或类晶体的结构。包涵体具有很高的密度(～13mg/mL)（Mukhopadhyay,1997），将细胞用高压匀浆结合溶菌酶处理或超声波裂解后，可低速离心收获。包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其他杂质。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质（Cowley et al,1997）,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白OmpT(37kD)在4～8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
2包涵体的变性溶解
包涵体蛋白溶解需要用很强的变性剂,比如6～8mol/L盐酸胍或6～8mol/L尿素。对于含有半胱氨酸的蛋白,如果包涵体中含有一些链间和/或链内活性或非活性二硫键，应加入巯基还原剂如DTT、GSH、β-ME等还原这些二硫键促溶。EDTA、EGTA等螯合剂,可清除金属离子带来的不必要的氧化反应。蛋白溶解后呈变性状态，氢键、疏水键完全破坏，疏水侧链完全暴露，呈可溶性伸展态，但一级结构和共价键不被破坏。
3蛋白质复性
当变性剂浓度降低或除去时，一部分蛋白质自发地从变性的热不稳定状态向热力学稳定状态转变形成具有生物学功能的天然结构，可自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性，又称再折叠( refolding)（纪剑飞等，1998）。体外折叠时，蛋白分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低（Fisher et al,1993）。虽然蛋白质的一级结构没变，但折叠恢复天然构象及活性的过程还受到周围环境的影响。为了获得正确折叠的活性蛋白质,必须要去除过量的变性剂和巯基还原剂,并把还原的蛋白转到氧化的环境中促使二硫键的形成。常用的方法有:稀释、透析、渗滤等。蛋白复性过程必须根据蛋白质不同而优化过程参数,如蛋白的浓度、温度、pH和离子强度等。对于含有二硫键的蛋白,复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供巯基氧化形成二硫键的环境，又称为氧化复性（oxidation refolding）。常用的方法有:空气氧化和使用氧化交换系统。空气氧化廉价、产率低；氧化交换系统正确配对的二硫键的产率更高，常用GSH/ GSSG，cysteine/ cystinecysteamine/ cystamine，DTT/ GSSG等。通常使用1～3mmol/L还原型巯基试剂,还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为101～51（Rudolph et al,1996）。当还原型和氧化型比例介于31到11之间时,可以得到最高的复性率（Hevchan et al,1997）。
4提高复性率的方法
体外复性时，蛋白要经过一系列的折叠中间体,最后形成天然构象。在蛋白的折叠过程中,部分折叠的中间体的疏水簇外露,分子间的疏水相互作用引起蛋白聚集。由于聚集是分子间的现象,聚集反应是二级(或高级)反应,而正确折叠却是一级反应,所以,聚集反应更依赖于高蛋白浓度。因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键（方敏等,2001）。减少聚集最直接的方法就是降低蛋白浓度。在蛋白浓度介于10～50μg/mL之间时,通常在100μg/mL以下，可以预期得到较高的复性率。
（1）快速稀释。用大量复性缓冲液直接加入变性蛋白中，降低变性剂浓度，透析除去变性剂，达到复性目的。将重组牛白细胞介素-2 复性，生物活性单位约为4×106U/L菌液（金红等，1998）。稀释的另一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入磁力搅拌的复性液中。在两次蛋白加入之间,应有足够的时间间隔使蛋白折叠通过了易聚集的早期中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白共聚集（Rudolph et al，1997）。
（2）温度跳跃策略。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集,直到易聚集的早期中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后,温度快速升高来促使中间体快速折叠成蛋白的天然构象（Xie et al,1996）。
（3）透析复性。用8mol/L盐酸胍变性蛋白，逐渐对含7、6、5、4、3、2、1mol/L盐酸胍的透析液透析，逐渐稀释,防止由于条件剧烈变化引起聚集。
（4）小分子添加剂促进复性 03～05mol/L的L-Arg是最常用的添加剂（Tandon et al,1988），但它们有可能干扰寡聚蛋白质的装配（De et al,1998）。 
（5）分子伴侣(chaperones)。属于热休克蛋白(heat shock protein,HSP)的亚类,可协助蛋白质多肽链的正确折叠，协助蛋白质的跨膜转运（Thromas et al,1997，Machidas et al,1998）。热休克蛋白CpkB对nrhTNF体外复性有促进作用（颜真，张英起，王俊楼，1999）。
近来，越来越多的有关蛋白质折叠的研究已转向利用分子伴侣GroE家族（董晓燕等，2000）。有些学者已成功地利用分子伴侣在体内和体外辅助蛋白质复性（杨晓仪等，2004）。GroE由GroES/GroEL（HSP60/HSP70）组成（Chothia et al,1990）。GroEL具有结合蛋白质的作用，相当于变性蛋白质的亲和配基。固定化GroEL柱(固定床)相当于变性蛋白质的亲和吸附层析柱，从而可提高样品的处理量，并使蛋白质在复性的同时得到浓缩和纯化，解决了将分子伴侣从复性的蛋白中去除的难题且该介质可以反复使用。对几种变性蛋白和久贮失活的酶进行了成功的复性层析（Altamirano et al,1997）。不过,该介质只适用于GroEL的作用底物。
人工分子伴侣促进复性(aritificial chaperone-assisted refolding)（Karuppiah N et al,1995）使用环糊精辅助碳酸酐酶B的复性。环糊精由淀粉通过环糊精葡萄糖基转移酶降解制得，是由D-吡喃葡萄糖单元以α-1，4-糖苷键相互结合成互为椅式构象的环状低聚糖，通常含有6～12个吡喃葡萄糖单元。有实用意义的是含6、7、8个吡喃葡萄糖单元的α、β、γ-环糊精，但α-环糊精空腔较小，γ-环糊精价格昂贵，常用的是β-环糊精(β-CD)（靳惠，1996），能形成包络化合物，客体分子从宽口端进入其分子空腔。包络物的形成主要靠非共价键相互作用如范德华力、氢键、疏水相互作用、几何形状匹配等。利用环糊精的疏水性空腔结合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。
模拟GroEL/GroES在体内的作用模式,Rozema和Gellman对人工分子伴侣体系(去污剂＋环糊精)辅助碳酸酐酶和鸡蛋白溶菌酶复性进行了研究（Rozema et al,1996）。与分子伴侣GroEL＋ATP辅助复性的作用机制相似：第一步捕获阶段，在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分子通过疏水相互作用与蛋白质的疏水位点结合形成复合体，抑制肽链间的相互聚集；第二步剥离阶段，加入环糊精，对去污剂分子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来，从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白质。CTAB（CETRIMONIUM BROMIDE），十六烷基三甲基溴化铵，溶于甲醇、乙醇、异丙醇，是良好的非离子表面活性剂，不受溶液pH值的影响。采用CTAB或CTAB与β-CD组成的人工分子伴侣均可以显著地提高重组人溶菌酶（rhlys）的复性率；对重组β-甘露聚糖酶（rMan）体系，单独采用CTAB不能辅助其复性，采用CTAB与β-CD组成的人工分子伴侣则具有明显辅助复性效果（王君等，2005）。
然而,不同蛋白的复性过程不同,特异的复性环境,包括缓冲液的组成、蛋白浓度、温度、pH等应根据蛋白的不同而异。一种蛋白质通过透析方法易获得较高的复性产率，而另外一种蛋白质则只能采用稀释，因此对于一个特定的蛋白质,选择何种方法需要反复试验（De,1998）。