肌醇代谢调节农杆菌介导转化机制的研究

肌醇（myo-inositol，MI）和植酸（IP6）是植物生长发育过程中不可或缺的重要生长调节物质。植酸是肌醇代谢下游磷酸化的*终产物，是植物种子储藏能量的主要物质，肌醇及其代谢下游的植酸合成和降解过程直接影响细胞的发育和组织的生长。该研究分别用外源肌醇预处理拟南芥（Arabidopsisthaliana）生态型Col-0植株的根系和MI代谢终端的植酸合成酶基因AtIPK1突变体atipk1的根做农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens，菌株A208）转化受体。采用形态观察、转录组测序、实时荧光定量检测、组织化学分析、高效离子色谱分析（HPIC）和遗传转化效率比较等方法探究外源MI和肌醇磷酸盐（IPs）代谢途径AtIPK1基因影响拟南芥根对农杆菌介导转化敏感性的作用机理。结果表明：外源肌醇和植酸代谢能够调节拟南芥愈伤组织的发育和生长，影响农杆菌介导拟南芥根受体转化效率。该研究为植物基因工程中提高农杆菌介导转化效率提供了研究基础和新思路。

前言
农杆菌转化是基因工程领域常用的一种转基因技术，该技术在一些双子叶植物上应用广泛，但在一些单子叶植物上难以到达理想的转化效率。针对于农杆菌转化机制的研究已有些成果，但是不足以完全清晰的解析农杆菌转化的作用机制。在如何提高农杆菌转化效率的研究中，使用一些物理或化学处理提高农杆菌转化效率是比较多见的方法，但是对其作用机制的解析不充分。为此，对于提高农杆菌转化效率及其机制的研究尚需努力。
本书中介绍的关于外源肌醇处理植物组织调节农杆菌转化效率的研究是一种新的研究思路。研究内容是以外源肌醇（myo-inositol，MI）预处理拟南芥（Arabidopsis thaliana）生态型Col-0植株的根系和MI代谢终端的植酸（IP6）合成酶基因AtIPK1突变体atipk1的根为农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，菌株A208）转化受体。采用形态观察、转录组测序、实时荧光定量检测、组织化学分析、高效离子色谱分析（HPIC）和遗传转化效率比较等方法探究外源MI和肌醇磷酸盐（IPs）代谢途径AtIPK1基因影响拟南芥根对农杆菌介导转化敏感性的作用机理。本书旨在通过外源化学物质的处理，调节植物代谢的物质平衡，改善农杆菌转过程中受体材料与菌株之间信息整合的有效性和可靠性。通过借鉴前人的研究基础，总结前期的经验和不足，分析肌醇代谢调控农杆菌转化可能的作用机制，能够为以后农杆菌转化的研究和应用提供参考。
全书共八章。章介绍了农杆菌的分类、农杆菌转化的过程、影响转化的主要因素等。第二章概述了肌醇在植物中生物合成、生物功能、特性和应用。第三章概述了肌醇磷酸化的相关酶类和产物，植酸是植物中肌醇代谢的终产物，肌醇合成植酸过程有诸多酶类的参与和调控。第四章介绍了外源肌醇对植物形态和组织细胞发育生长的直接影响。第五章阐述了外源肌醇处理根受体的转化效率有显著差异，基因表达水平在转化前后存在时效性，MI 处理的根和根愈伤组织中IP6含量高于MI-处理，Pi含量则相反，外源添加MI调节和维持细胞的生长发育有重要作用，影响了植物细胞的物质代谢水平。第六章通过转录组分析，解析了外源肌醇对植物转录因子调控作用，挖掘了至少184个未注释新基因和183个差异表达基因（DEGs）。基因功能注释表明DEGs涉及植物细胞壁的合成、激素信号调节、胁迫响应（植物防御）、物质转运、染色体修饰和DNA修复、次生物质代谢等过程。第七章阐释了AtIPK1缺失对植物生长表型和农杆菌转化的敏感性有调节作用，影响无机磷和植酸动态平衡。第八章表述了AtIPK1基因对影响农杆菌转化的相关基因有可能起调节作用，对受体转化敏感性有显著作用的可能是多个因子协同工作的结果。
本书所涉及的研究工作和撰写内容参阅了大量的文献资料，选用了一些图表和结论，在此向相关作者致以诚挚的感谢，对指导和帮助我完成该研究的老师、同学表示衷心的谢意。
鉴于本书的撰写时间较仓促，作者研究和撰写水平有限，书中难免存在疏漏和不妥之处，望读者予以批评指正，提出宝贵意见。

著者2018年9月24日

章农杆菌介导转化概论
节农杆菌介导转化的目的和意义
农杆菌介导（Agrobacterium-mediated）的遗传转化是众多植物转化技术（如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、PEG法、电击法、显微注射法、浸渍法等)中常用的一种方法。农杆菌转化技术具有操作简单、成本低、转化DNA片段明确、基因拷贝数低、发生转基因沉默相对较少、转移的基因片段较长、转化效率相对较高等优点。
目前，利用农杆菌介导的转化技术不仅可以解决人类日益增长的粮、油、棉、草等植物产品原料的需求，而且对于研究基因、蛋白和物质代谢等生化和生理作用机理有重要帮助。利用转基因植物作为生物反应器，人们在烟草、马铃薯、苜蓿、番茄等植物中表达产生了抗体、疫苗及人胰岛素、干扰素等多种药用蛋白（陈宏等，2004）。农杆菌介导的转化技术是特异性基因的表达和诱导能力鉴定的强有力工具（Birch，1997），能够直接检测植物生理学中用生物化学方法难以解决的一些假设,例如特异性酶对光合作用产物的分配影响、细胞信号传导调控有性生殖和植物与微生物互作的分子遗传分析（Herbers et al.，1996）等。
农杆菌介导转化技术是植物品种改良的有效工具（Birch，1997），已通过农杆菌转化得到的转基因改良作物有数百种，包括水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜、高粱、番茄、甘蔗、苜蓿、黑麦草、早熟禾等（Chai et al.，2003；叶兴国等，2012；Zhang et al.，2013）。相对于绝大多数的植物而言，农杆菌介导的转化植物种类还很有限，其农杆菌介导的转化机理尚不完全清楚，T-DNA整合机理以及现有的提出模型不能解释所有的在农杆菌介导植物的转化机制（Dafny-Yelin，2008；Ziemienowica et al.，2008），还需要更多的探索，这种情况使得研究农杆菌转化机理显得尤为重要。
在植物育种工程中，传统的植物品种改良和育种需要经历数年的筛选和鉴定，一个品种的育成是一个耗时耗力的过程，并且存在很大的投资风险，成果难以保障。在遗传学中，传统生物学方法对于品系和个体性状控制因子的发掘和鉴定不能精确定位，难以明确具体的功能定位。但是，随着基因功能领域方法和技术的进步，一些生物物理、生化和生物互作研究的发展，农杆菌转化技术成为普遍应用的基因工程方法，有效地缩短了育种的时间，降低了成本，能够精准定位性状控制因子的功能。
农杆菌介导转化植物的目的就是利用该技术的优势缩短传统育种中烦琐的、长时间的工作状态，减少工作量和研究成本，提高工作效率，通过抗性筛选鉴定转基因后代，有针对性的、准确的改良植物农艺性状，为植物分子遗传研究、品种改良、基因功能分析等领域提供有效的基础研究材料。研究农杆菌转化机制对于提高植物遗传转化效率有着重要的的意义。农杆菌对于双子叶植物的转化是比较容易的，使用的受体材料多样，转化效率高。但是，在许多单子叶植物和木本植物中，农杆菌转化效率很低，可选的受体材料有严格限制。为此，为了推广农杆菌介导转化方法在植物中的应用，提高难以转化材料的转化效率，通过一些物理、化学等手段调节农杆菌和植物受体的代谢、组织结构以及所处环境条件，使之农杆菌中T-DNA高效整合到植物寄主细胞染色体上，并且有效发挥T-DNA 目的基因的功能，解析转化过程中的作用机制，对于加速基因工程和分子生物学的研究进程有重要意义。
第二节农杆菌介导转化概述
一、农杆菌概述
农杆菌（Agrobacterium）是一类广泛存在习居于土壤的革兰氏阴性细菌，菌体无芽孢短杆状，以1～6根周生或侧生鞭毛运动，好气性，呼吸型，适宜生长温度为25～28℃，适酸碱度pH值为60，在细菌分类学上隶属于根瘤菌科（Rhizobiaceae conn 1938），归为薄壁菌门的土壤杆菌属（Agrobacterium conn 1942）（王金生，2000）。土壤杆菌属细菌细胞壁与其他革兰氏阴性细菌相似，粘肽有谷氨酸、丙氨酸、二氨基庚二酸和氨基糖组成，有些土壤杆菌的粘肽还发现有大量的亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和天冬氨酸。土壤杆菌纯化脂多糖的脂肪酸成分是特殊的3-羟基四葵酸和 3-羟基六葵酸。细菌能够利用三羧酸循环的中间产物和一些氨基酸作为碳源。葡萄糖分解代谢主要通过Entnerd Doudoroff途径和戊糖途径，三羧酸循环也是重要的代谢途径。
（一）农杆菌的种类
根据土壤杆菌属侵染寄主产生的病害症状和寄主范围分类，并且根据自身的生理生化性状划分生物型。目前主要的农杆菌种类包括：根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）、放射土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）、悬钩子农杆菌（Agrobacterium Rubi）、葡萄土壤杆菌（Agrobacterium vitis）、还有一种在垂榕（Ficus benjamina）上形成冠瘿瘤的称为 Agrobacterium larrymoorei（Bouzart and Jones et al，2001）等。
随着生物技术的发展，农杆菌种类的划分依据也在发生变化。据Kerr（1969）报道，通过把 Agrobacterium tumefaciens致病基因导入到Agrbacterium radiobacter，Agrobacterium radiobacter就具有了和Agrobacterium tumefaciens一样的致病性。这表明根据致病性产生的病害症状和寄主范围为依据的分类不准确，理由是土壤杆菌的致病性主要是由质粒可控制，相同的质粒所诱导的病害症状是相同的，而且这些质粒可以在适当条件下在不同菌体间转移。因此，根据农杆菌的表型和遗传多样性将农杆菌重新划分种（以种类不同的生物型划分种）：以Agrobacterium tumefaciens为种名的所有生物型(biovarⅠ）菌株，包括能引起根癌病的Agrobacterium tumefaciens和没有致病性的 Agrobacterium radiobacter；以Agrobacterium rhizogenes为种名的第二生物型(biovarⅡ）菌株；Agrobacterium vitis为第三生物型(biovarⅢ）菌株种名；Agrobacterium Rubi仍为单独的一个种,也有人把它分类在Agrobacterium tumefaciens生物型中（Bouzart，1994；Sawada et al.，1993）。重新划分后的Agrobacterium tumefaciens含有原来分布在三个种内（Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium rhizogenes和Agrobacterium radiobacter）菌株，而重新划分后的Agrobacterium rhizogenes含有原来分布在两个种类（Agrobacterium rhizogenes和Agrobacterium tumefaciens）的菌株。其中Agrobacterium tumefaciens是农杆菌中的模式菌株（Bouzart，1994）。目前，3个生物型都有代表菌株完成了全基因组测序（Slater et al.，2009）。尽管这些农杆菌种的分类系统有了新的发展，但是农杆菌种的分类仍然没有终定论。随着各种分类学方法的发展，农杆菌的分类系统不断推陈出新（Tighe et al.，2000；Young et al.，2001；Goodner et al.，2001）。
（二）农杆菌的寄主范围
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens）和发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogens）是农杆菌的主要两类致病菌，它们侵染的天然宿主大部分是双子叶植物和裸子植物，单子叶植物报道较少，这两类菌侵染植物后分别产生肿瘤和毛状根，其余几种农杆菌的寄主范围比较狭窄。根癌农杆菌侵染植物后产生肿瘤细胞，这些肿瘤细胞能够产生一类特殊的氨基酸衍生物——冠瘿碱作为病菌的碳氮来源，Ti质粒不仅控制细菌的致病性，还控制对细菌素Agrocin84的敏感性和寄主范围（王金生，2000）。
研究表明，Agrobacterium tumefaciens菌株能将外源的DNA转移到双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、微生物（包含酵母、真菌）甚至是人类细胞中（De-Cleen et al.，1976；Conner et al.，1992；Vageeshbabu，2004）。关于农杆菌寄主范围的分子遗传学特性仍在不断的探索中，以前人们认为农杆菌寄主范围是由致病质粒（例如Ti质粒和Ri质粒）决定，而近年来的研究发现，农杆菌寄主范围可能由于农杆菌和寄主多个基因共同决定（Toki，1997；Tingay et al.，1997；Cheng et al.，1997）。寄主范围还可能由致病质粒和农杆菌染色体基因的相互作用来决定，如pTiBo542质粒在其天然寄主根癌农杆菌Bo542中时，限制了产生冠瘿瘤的潜力；但当置于农杆菌C58的染色体背景下时，pTiBo542产生了强烈的浸染力（Nam et al.，1997）。由此可见，农杆菌的寄主范围不是由单方面的因素所决定的，在致病质粒、农杆菌染色体基因和寄主植物因子之间存在复杂的关系，它们共同决定着农杆菌的寄主范围。
（三）根癌农杆菌病害
根癌农杆菌（Atumefaciens）主要引起冠瘿病，其症状的主要特征是形成各种大小和形状的瘿和瘤，发生部位主要在根和茎秆上。侵染部位一般在伤口位置，侵染初期形成白色、圆形、柔软的增生组织小块。随后小块逐渐形成肿瘤增大，其表面呈螺旋状，外层组织呈现暗褐色或黑色，有些木质化，呈多瘤或结节状，直径可达30cm。一些海绵状的肿瘤易碎或从植物上脱落，还有一些肿瘤在秋季腐烂来年再生。此外，被侵染植株可能形成次生肿瘤，次生肿瘤部位不存在病原细菌。但是，次生肿瘤可以通过嫁接转移。因此，可以认为，在病原菌在侵染植物后，一旦形成肿瘤，自身就能够产生刺激细胞恶性生长的物质，这些物质是由于植物细胞吸收了细菌细胞中的T-DNA，刺激了生长素和激动素的产生或增加。此外，受害植株还可能呈现矮化，叶片变小、褪绿，对不利的环境条件更易感病（王金生，2000；George NAgrios著，沈崇尧译，2009）。
根癌农杆菌可在受侵染的土壤中作为腐生物越冬并存活多年。病原菌致病的基因携带于Ti质粒中，基因表达刺激寄主细胞分裂，产生肿瘤，肿瘤细胞增加造成组织扭曲或破碎。有时木质部导管受肿瘤细胞挤压后会使植物上不运输的水分降低到正常水平的20%（George NAgrio著，沈崇尧译，2009）。新形成的肿瘤会受到昆虫或其他腐生微生物的破坏或侵染，病害细菌进入土壤随水传播扩撒。肿瘤的维管束没有功能，其营养的获得受到限制，成熟后的肿瘤逐渐坏死脱落，或消失活在来年形成新的肿瘤。主要的病害有苹果根癌病、梨树根癌病、杏芽癌病、葡萄根癌病、枣根癌病等等。此外，农杆菌还侵染在桃、樱桃、玫瑰、番茄、烟草等植物（陈立锋等，2001；董金皋，2001）。
在农杆菌病原的防治方面目前还没有直接针对病原菌有效防治措施(Escobar et al.，2003）。一些间接的防治措施主要通过培育无菌苗和改进嫁接方式、田间轮作、减少植物颈基部和根部创伤、利用K84土壤杆菌素和K1026等进行生物防治（Burr et al.，1998）、切除肿瘤、防治地下害虫等方法防治土壤农杆菌，其主要还是以预防为主（陈立锋等，2001；董金皋，2001）。
二、农杆菌介导转化
在植物转基因工程中，利用不同的遗传转化技术有选择地将外源基因转移到受体植物，使转化载体在植物定向遗传改良上实现相对稳定的遗传和高效的表达，在种质资源利用和植物遗传育种实践中突显出越来越重要的作用。这些遗传转化方法有很多种，主要分为两大类：一类是无载体导入的基因的直接转化，例如基因枪法、点击法、PEG法等；另一类是通过载体介导的转化，例如农杆菌介导的转化。在这些转化方法中，农杆菌介导的转化是操作相对简单、转化效率高、插入片段稳定性好、转基因拷贝数低和成本低的一种转基因策略的方法（Hamilton et al.，1996；Zhu et al.，2010）。
在植物遗传转化体系中，发根农杆菌和根癌农杆菌是两种常用于植物细胞转化的农杆菌。这两种农杆菌转化的主要机理是分别通过Ri质粒和Ti质粒中T-DNA片段转移进植物细胞，在植物细胞中由细胞质进入细胞核，终到达植物细胞染色体，插入植物基因组，并表达其基因功能。根癌农杆菌致瘤菌株都包含一个200～800kb的环状质粒，包括毒性区（Vir区）、转移区（T-DNA区，10～30kb）、结合区（Con区）和复制区起始区（Ori区），其中Vir区和T-DNA区与冠瘿瘤生成有直接关系。根据冠瘿碱类型将常见的土壤杆菌分为章鱼碱型（octopine）、胭脂碱型（nopaline）、白氨碱型（leueinopine）和琥珀碱型（succinoPine）四类菌株。不同类型土壤杆菌菌株的质粒有基因结构和功能上的变化，但形成根癌病的机理相同。
Ti质粒上的致瘤基因存在于质粒的T-TDNA和Vir区。研究表明，T-DNA两端有被称作边界的顺向不完全重复约25bp的特殊序列（TL和TR），两边界之间构成完整的转移单位。右边界附近通常有促进T-DNA转移的增强序列（overdrive）。边界序列是T-DNA向寄主细胞转移的顺式作用元件,而T-DNA编码生长素合成酶基因（tms或iaa）、细胞分裂素合成酶基因（tmr或ipt）和冠瘿碱合成有关的基因（ocs或nos或mas）。T-DNA转移、整合进植物基因组之后，生长素合成酶基因和细胞分裂素基因的表达造成植物激素的过量生成，引起植物细胞的无限制分裂和生长，从而形成肿瘤；而冠瘿碱合成酶基因的表达则提供了致瘤土壤杆菌赖以生长、繁殖必需的营养（Gelvin，2003）。
Ri质粒为双链共价闭合环状DNA，其大小在180～250kb之间。Ri质粒分为4种类型：农杆碱型（agropine type）、甘露碱型（mannopine type）、黄瓜碱型（cucumopine type）和异黄瓜碱型（mikimopine type）（Kiyakawa  et al.，1994）。Ri质粒类型决定着发根农杆菌的致根特性。有研究发现携带农杆碱型Ri质粒的农杆菌比携带甘露碱型、黄瓜碱型Ri质粒的农杆菌有更广的宿主范围，并且同一种农杆菌对不同寄主植物或同一寄主植物的不同器官敏感性也不同（Petit et al.，1983）。农杆碱型Ri质粒上的T-DNA是不连续的，甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒的T-DNA是连续的。发根农杆菌主要用于理论研究、转基因植物和新品种培育、获得次生代谢产物和促进植物生根等。相对于发根农杆菌的研究，根癌农杆菌是研究其理论和应用更为深入和广泛的农杆菌。本书在这里主要探讨以根癌农杆菌（Atumefaciens）为代表的农杆菌的应用和作用机制。转化过程重要包括：农杆菌与植物的识别与附着、vir基因的表达和活化、T-DNA链和Vir蛋白的转运、T-DNA链复合体的形成和宿主细胞内转运、T-DNA复合体进入宿主核内、T-DNA整合到染色体上、T-DNA基因的表达（图1-1）。
图1-1农杆菌介导转化植物细胞模型
(引自McCullen and Binns，2006)

根癌农杆菌（Atumefaciens）是广泛应用与植物转化体系研究中的一类农杆菌，也是研究较为清楚和成功的农杆菌，在已获得生物200多种转基因植物中约有80%是由此菌介导转化（王关林等，1998）。双子叶植物是根癌农杆菌的天然寄主，因此双子叶植物的农杆菌介导的遗传转化效率相对单子叶植物是比较高的。随着近年来农杆菌体系的不断发展，根癌农杆菌在单子叶植物的转化中的应用有了较大的进步。