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开 本: 16开包 装: 平装胶订是否套装: 否国际标准书号ISBN: 9787030579348丛书名: 高等医药院校基础医学实验教学规划教材
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医用化学,生物化学,医学院校,教学参考资料,医药学,分子生物学,医学院校,教学参考资料
内容简介
《医学生物化学与分子生物学实训指导》分为三篇。**篇为常用实验技术，包括分光光度技术、色谱技术、电泳技术、离心技术、蛋白质的分离与纯化、基因工程技术。第二篇为生物化学实验，第三篇为分子生物学实验。其中生物化学实验根据难度和要求，分为基础实验、提高型实验、综合型实验和研究创新型实验四个层次。基础实验有蛋白质含量的测定等，提高型实验有血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳等，综合型实验有血清白蛋白和球蛋白的盐析分离及总蛋白的测定，研究创新型实验有肝糖原的提取与鉴定等。此外，《医学生物化学与分子生物学实训指导》附录附有实验室常用数据，如不同动物血糖正常值等实验数据。
目 录
目录
**篇 常用实验技术 1
**章 分光光度技术 1
第二章 色谱技术 4
**节 色谱法的概念及特点 4
第二节 常用的色谱方法 5
第三章 电泳技术 10
**节 基本原理 10
第二节 醋酸纤维素薄膜电泳 11
第三节 琼脂糖凝胶电泳 11
第四节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 13
第五节 染色方法 17
第四章 离心技术 19
**节 离心理论 19
第二节 离心机操作要领 21
第五章 蛋白质的分离与纯化 22
**节 蛋白质分离与纯化的原理及方法 22
第二节 蛋白质的浓缩、干燥和保存 23
第六章 酶学分析 25
第七章 基因工程技术 28
**节 概述 28
第二节 聚合酶链反应扩增获取目的基因 28
第三节 基因载体的选择 29
第四节 基因工程常用的工具酶 30
第五节 重组体的构建 31
第六节 重组体导入受体细胞 31
第七节 重组子的筛选与鉴定 32
第二篇 生物化学实验 34
第八章 基本实验 34
实验一 蛋白质含量的测定 34
【同步练习题】 40
实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离 42
实验三 血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离 43
实验四 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白 44
实验五 动物组织中核酸的提取与鉴定 46
【同步练习题】 48
实验六 蛋白质的透析纯化 51
实验七 血清过氧化氢酶Km值的测定 51
【同步练习题】 54
实验八 血糖含量的测定 56
实验九 胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响 59
【同步练习题】 60
实验十 血清三酰甘油（TG）含量的测定 63
【同步练习题】 66
实验十一 酮体的生成和利用 67
实验十二 血浆高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-Ch）含量的测定 71
【同步练习题】 72
实验十三 血清谷丙转氨酶（ALT）活性的测定 73
【同步练习题】 75
第九章 提高型实验 76
实验十四 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳 76
实验十五 琥珀酸脱氢酶的抑制作用 78
第十章 综合型实验 80
实验十六 血清白蛋白和球蛋白的盐析法分离、白/球比及总蛋白的测定 80
第十一章 研究创新型实验 82
实验十七 肝糖原的提取与鉴定 82
实验十八 不同组织ALT活性测定及温度、pH 的影响 82
附：“肝糖原的提取与鉴定”的原理和方法 83
第三篇 分子生物学实验 84
第十二章 分子生物学实验技术 84
实验十九 动物白细胞中DNA的提取（碘化钠法） 84
实验二十 组织细胞总RNA的提取 85
实验二十一 核酸的凝胶电泳 86
方案一 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 89
方案二 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 90
实验二十二 DNA为模板的聚合酶链式反应扩增 91
【同步练习题】 92
实验二十三 质粒DNA的提取（碱变性裂解法） 93
【同步练习题】 94
实验二十四 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 95
实验二十五 载体与目的基因的连接 96
附录 实验室常用数据 97
**篇 常用实验技术 1
**章 分光光度技术 1
第二章 色谱技术 4
**节 色谱法的概念及特点 4
第二节 常用的色谱方法 5
第三章 电泳技术 10
**节 基本原理 10
第二节 醋酸纤维素薄膜电泳 11
第三节 琼脂糖凝胶电泳 11
第四节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 13
第五节 染色方法 17
第四章 离心技术 19
**节 离心理论 19
第二节 离心机操作要领 21
第五章 蛋白质的分离与纯化 22
**节 蛋白质分离与纯化的原理及方法 22
第二节 蛋白质的浓缩、干燥和保存 23
第六章 酶学分析 25
第七章 基因工程技术 28
**节 概述 28
第二节 聚合酶链反应扩增获取目的基因 28
第三节 基因载体的选择 29
第四节 基因工程常用的工具酶 30
第五节 重组体的构建 31
第六节 重组体导入受体细胞 31
第七节 重组子的筛选与鉴定 32
第二篇 生物化学实验 34
第八章 基本实验 34
实验一 蛋白质含量的测定 34
【同步练习题】 40
实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离 42
实验三 血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离 43
实验四 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白 44
实验五 动物组织中核酸的提取与鉴定 46
【同步练习题】 48
实验六 蛋白质的透析纯化 51
实验七 血清过氧化氢酶Km值的测定 51
【同步练习题】 54
实验八 血糖含量的测定 56
实验九 胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响 59
【同步练习题】 60
实验十 血清三酰甘油（TG）含量的测定 63
【同步练习题】 66
实验十一 酮体的生成和利用 67
实验十二 血浆高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-Ch）含量的测定 71
【同步练习题】 72
实验十三 血清谷丙转氨酶（ALT）活性的测定 73
【同步练习题】 75
第九章 提高型实验 76
实验十四 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳 76
实验十五 琥珀酸脱氢酶的抑制作用 78
第十章 综合型实验 80
实验十六 血清白蛋白和球蛋白的盐析法分离、白/球比及总蛋白的测定 80
第十一章 研究创新型实验 82
实验十七 肝糖原的提取与鉴定 82
实验十八 不同组织ALT活性测定及温度、pH 的影响 82
附：“肝糖原的提取与鉴定”的原理和方法 83
第三篇 分子生物学实验 84
第十二章 分子生物学实验技术 84
实验十九 动物白细胞中DNA的提取（碘化钠法） 84
实验二十 组织细胞总RNA的提取 85
实验二十一 核酸的凝胶电泳 86
方案一 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 89
方案二 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 90
实验二十二 DNA为模板的聚合酶链式反应扩增 91
【同步练习题】 92
实验二十三 质粒DNA的提取（碱变性裂解法） 93
【同步练习题】 94
实验二十四 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 95
实验二十五 载体与目的基因的连接 96
附录 实验室常用数据 97
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**篇 常用实验技术
**章 分光光度技术
有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。从一个有连续光谱的光源，逐步地分出各个波长的光，使其透过含待测物的真溶液，测出其在不同波长时的光密度，然后以波长为横坐标，以光密度为纵坐标，就可以得到待测物的吸收光谱曲线，由此找出其中吸收*强的波长，作为灵敏光波长对该待测物进行定量测定。分光光度法主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是朗伯（Lambert）定律和比尔（Beer）定律。
一、光的基本知识
光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征，可用下式表示：
式中，λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长；υ 为频率，即每秒钟振动次数；c为光速，等于（299 770±4）km/s。光属于电磁波。
自然界存在各种不同波长的电磁波（表1-1）。分光光度法所使用的光谱范围在200nm～l0μm（1μm＝1000nm）。其中200～400nm 为紫外光区，400～760nm 为可见光区，760～10 000nm 为红外光区。
表1-1 电磁波谱
二、朗伯-比尔定律
朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律是比色分析的基本原理，这个定律讨论的是有色溶液对单色光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度之间的定量关系。
1. 朗伯定律 一束单色光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱。若溶液浓度不变，则溶液的厚度越大（即光在溶液中所经过的路径越长），光的强度减低越显著。
设光线通过溶液前的强度为I0（入射光的强度），通过液层厚为L的溶液后光的强度为I（t 透射光的强度），则表示透射光的强度是入射光强度的几分之几，称为透光度（transmittance），用T 表示。透光度随溶液厚度的增加而减少，但实践证明，透光度和溶液层厚度之间并不存在简单的定量关系，只有透光度的负对数（lgT）才随着溶液厚度的增加而成正比例增加，即
将上述比例写成等式，得到，式中，称为吸光度（absorbance，A），或光密度（optical density，D），所以
式中，K1 为比例系数，其值取决于入射光的波长、溶液的性质和浓度，以及溶液的温度等。上式表明，当溶液的浓度不变时，吸光度与溶液液层的厚度成正比，这就是朗伯定律。
2. 比尔定律 当一束单色光通过有色溶液后，溶液液层的厚度不变而浓度不同时，溶液浓度越大，则透射光的强度越弱，其定量关系如下：
式中，C 为有色物质溶液的浓度，K2 为比例系数，其值取决于入射光的波长、溶液的性质和液层的厚度，以及溶液的温度等。上式表明，当溶液液层的厚度不变时，吸光度与溶液的浓度成正比，这就是比尔定律。
3. 朗伯-比尔定律 如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必须将朗伯定律和比尔定律合并起来，得
吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比，这就是朗伯-比尔定律。
在上式中，若L用厘米（cm）表示，C 用克/升（g/L）表示，则比例常数K 称为吸光系数，其值取决于入射的波长、溶液的性质和温度等，而与光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。
若L用厘米（cm）表示，C用摩尔/升（mol/L）表示，则上式中的比例常数用ε 表示，得
式中，ε称为物质的摩尔吸光率（molar absorptivity）或摩尔吸光系数（molar absorption coefficient）。
不同的物质可能会有相同的**吸收波长，但其摩尔吸光率不一定相同。ε值越大，说明该物质溶液对光的吸收越强烈，则比色测定的灵敏度越高。
三、分光光度技术的应用
1. 测定溶液中物质的含量 可见分光光度法或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。这需要测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，将两者进行比较。由于所用比色皿的厚度是一样的，可用下式进行计算：
式中，Cx 代表未知液的浓度，Cs 代表标准液的浓度，Ax 和As 分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值。式中只有Cx 是未知的，可由上式计算得之。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。
含量测定时所用波长通常要选择被测物质的**吸收波长，这样做有两个好处：一是灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；二是可以避免其他物质的干扰。还可利用摩尔吸光率（ε）求得测定物质的浓度，由于物质的ε 是已知的，读取光径（液层厚度）为1cm 时溶液的吸光度（A），则可计算溶液中物质的浓度（C）。
此式常在紫外光吸收法时应用，无需显色反应，操作方便。
2. 用紫外光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。
各种物质有其自己的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线形状一样时，则它们很可能是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低谷的波长是一定不变的。
紫外光吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物能表现出吸收峰。紫外光吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外光吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物的结构，必须与其他方法配合。因此，紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。
（李珊）
第二章 色谱技术
**节 色谱法的概念及特点
1903 年，俄国科学家M. C. Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法（chromatography）。20 世纪50 年代开始，相继出现了气相色谱、液相色谱、高效液相色谱、薄层色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等。
一、色谱法的概念
色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等），使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相称为固定相（stationary phase），另一相流过此固定相称为流动相（mobile phase）。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力不同，因而各组分的移动速度不同，这样，结构上只有微小差异的各组分才能得到分离。蛋白质纯化的许多技术，就是利用色谱法（表2-1）。
二、色谱法的特点
1. 具有极高的分辨效力 只要选择好适当的色谱法（色谱类型、色谱条件），就能很好地分离理化性质极为相近的混合物。
2. 具有极高的分析效率 对某一混合组分，只需几十分钟乃至几分钟就可完成一个分析周期。如用高效薄层色谱（high performance thin layer liquid chromatography，HPTLC）一次仅10 分钟就可完成40 个样品的点样和分析工作。
3. 具有极高的灵敏度 样品组分含量仅数微克，或不足1μg 都可进行很好的分析。现代的气相色谱仪由于使用了高灵敏的检测器，可检出1×10？13～1×10？11g 的样品组分。
4. 操作简便，应用广泛 它广泛地应用于工农业、化学、化工、医药卫生、环境保护、大气监测等各个方面，是现代实验室中常用的分析手段之一。
表2-1 蛋白质的纯化技术
当然，色谱法也有它的局限性：①在定量分析中需要纯制的标准物质；②不能精确地解决物质的化学结构问题。
第二节 常用的色谱方法
一、吸附色谱
吸附色谱（absorption chromatography）是指混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附力，从而不同组分随流动相移动的速度不同，*终可将混合物中不同组分分离的方法。这种分离方法取决于待分离物质被吸附剂固定相所吸附的能力，以及它们在分离时所用的溶剂流动相中的溶解度这两个方面的差异。根据操作方式不同，吸附色谱可分为柱色谱（column chromatography）和薄层色谱（thin layer chromatography）两种。
（一）柱色谱
在柱吸附色谱中，混合物的分离是在装有适当吸附剂的玻璃管柱中进行的，色谱柱下端铺垫棉花或玻璃棉，柱内充填溶剂湿润的吸附剂，待分离样品自柱顶部加入，样品完全进入吸附柱后，再用适当的溶液（洗脱液）洗脱。假如待分离的样品内含有A、B 两种成分，在洗脱过程中随着流动相流经固定相，它们在柱内分别连续地产生溶解、吸附、再溶解的现象。由于洗脱液和吸附剂对A、B 的溶解力与吸附力不同，A、B 在柱内移动的速率也不同。溶解度大而吸附力小的物质走在前面，相反，溶解度小而吸附力大的物质走在后面。经过一段时间以后，A、B 两种物质可在柱的不同区域各自形成环带。如A、B 为有色物质，就可以看到不同的色层，每个色带就是一种纯物质。然后继续用洗脱液洗脱，分段收集，直到各组分按顺序先后完全从柱中洗出为止。
（二）薄层色谱
薄层色谱利用的方法是把吸附剂均匀地铺在玻璃板或塑料膜上形成薄层，将待分离的样品点在薄层一端，在密闭容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开，由于吸附剂对不同物质吸附力大小不同，因此当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，易被吸附的物质相对移动较慢，较难吸附的物质则相对地移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质就被彼此分开，*后形成互相分离的斑点。
薄层色谱的特点是：①灵敏度高，可检出微量物质；②分离能力强，斑点集中；③展开时间短；④操作简便，适于很多微量样品分离鉴定。
（三）常用的吸附剂
色谱用吸附剂应满足两个要求：一是要有较大的吸附表面和一定的吸附能力，对不同的物质吸附力不同，而且不能与被吸附的物质及洗脱液（或展开剂）发生反应：二是吸附剂粒度大小适中，不宜过粗（展开太快，分离效果差），也不宜太细（展开过慢，斑点易于扩散）。一般来说，薄层色谱所用吸附剂的粒度较细，如硅胶要求200 目左右。
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等。
（四）洗脱液（展开剂）
不论是柱色谱还是薄层色谱，在选择洗脱液或展开剂时应符合以下条件：①一般应使用比较纯的试剂，含有杂质常会影响洗脱能力；②与样品、吸附剂不发生化学反应；③能溶解样品中的各成分；④黏度小、流动性好，不致洗脱或展开太慢；⑤容易与所要分离的成分分开。
选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、洗脱液及被分离物质三方面考虑，一般用亲水性吸附剂（如硅胶、氧化铝）作色谱分离时，若被测组分极性较大，应选用吸附性较强（活动较低）的吸附剂，用极性较大的洗脱液或展开剂；若被测组分亲脂性较强，应选用较强（活动较高）的吸附剂及极性较小的洗脱液或展开剂。常用洗脱液或展开剂极性递增的次序是：石油醚＜环己烯＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜氯仿＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。
二、分配色谱
分配色谱（partition chromatography）是利用混合物在两种
**章 分光光度技术
有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。从一个有连续光谱的光源，逐步地分出各个波长的光，使其透过含待测物的真溶液，测出其在不同波长时的光密度，然后以波长为横坐标，以光密度为纵坐标，就可以得到待测物的吸收光谱曲线，由此找出其中吸收*强的波长，作为灵敏光波长对该待测物进行定量测定。分光光度法主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是朗伯（Lambert）定律和比尔（Beer）定律。
一、光的基本知识
光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征，可用下式表示：
式中，λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长；υ 为频率，即每秒钟振动次数；c为光速，等于（299 770±4）km/s。光属于电磁波。
自然界存在各种不同波长的电磁波（表1-1）。分光光度法所使用的光谱范围在200nm～l0μm（1μm＝1000nm）。其中200～400nm 为紫外光区，400～760nm 为可见光区，760～10 000nm 为红外光区。
表1-1 电磁波谱
二、朗伯-比尔定律
朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律是比色分析的基本原理，这个定律讨论的是有色溶液对单色光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度之间的定量关系。
1. 朗伯定律 一束单色光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱。若溶液浓度不变，则溶液的厚度越大（即光在溶液中所经过的路径越长），光的强度减低越显著。
设光线通过溶液前的强度为I0（入射光的强度），通过液层厚为L的溶液后光的强度为I（t 透射光的强度），则表示透射光的强度是入射光强度的几分之几，称为透光度（transmittance），用T 表示。透光度随溶液厚度的增加而减少，但实践证明，透光度和溶液层厚度之间并不存在简单的定量关系，只有透光度的负对数（lgT）才随着溶液厚度的增加而成正比例增加，即
将上述比例写成等式，得到，式中，称为吸光度（absorbance，A），或光密度（optical density，D），所以
式中，K1 为比例系数，其值取决于入射光的波长、溶液的性质和浓度，以及溶液的温度等。上式表明，当溶液的浓度不变时，吸光度与溶液液层的厚度成正比，这就是朗伯定律。
2. 比尔定律 当一束单色光通过有色溶液后，溶液液层的厚度不变而浓度不同时，溶液浓度越大，则透射光的强度越弱，其定量关系如下：
式中，C 为有色物质溶液的浓度，K2 为比例系数，其值取决于入射光的波长、溶液的性质和液层的厚度，以及溶液的温度等。上式表明，当溶液液层的厚度不变时，吸光度与溶液的浓度成正比，这就是比尔定律。
3. 朗伯-比尔定律 如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必须将朗伯定律和比尔定律合并起来，得
吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比，这就是朗伯-比尔定律。
在上式中，若L用厘米（cm）表示，C 用克/升（g/L）表示，则比例常数K 称为吸光系数，其值取决于入射的波长、溶液的性质和温度等，而与光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。
若L用厘米（cm）表示，C用摩尔/升（mol/L）表示，则上式中的比例常数用ε 表示，得
式中，ε称为物质的摩尔吸光率（molar absorptivity）或摩尔吸光系数（molar absorption coefficient）。
不同的物质可能会有相同的**吸收波长，但其摩尔吸光率不一定相同。ε值越大，说明该物质溶液对光的吸收越强烈，则比色测定的灵敏度越高。
三、分光光度技术的应用
1. 测定溶液中物质的含量 可见分光光度法或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。这需要测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，将两者进行比较。由于所用比色皿的厚度是一样的，可用下式进行计算：
式中，Cx 代表未知液的浓度，Cs 代表标准液的浓度，Ax 和As 分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值。式中只有Cx 是未知的，可由上式计算得之。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。
含量测定时所用波长通常要选择被测物质的**吸收波长，这样做有两个好处：一是灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；二是可以避免其他物质的干扰。还可利用摩尔吸光率（ε）求得测定物质的浓度，由于物质的ε 是已知的，读取光径（液层厚度）为1cm 时溶液的吸光度（A），则可计算溶液中物质的浓度（C）。
此式常在紫外光吸收法时应用，无需显色反应，操作方便。
2. 用紫外光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。
各种物质有其自己的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线形状一样时，则它们很可能是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低谷的波长是一定不变的。
紫外光吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物能表现出吸收峰。紫外光吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外光吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物的结构，必须与其他方法配合。因此，紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。
（李珊）
第二章 色谱技术
**节 色谱法的概念及特点
1903 年，俄国科学家M. C. Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法（chromatography）。20 世纪50 年代开始，相继出现了气相色谱、液相色谱、高效液相色谱、薄层色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等。
一、色谱法的概念
色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等），使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相称为固定相（stationary phase），另一相流过此固定相称为流动相（mobile phase）。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力不同，因而各组分的移动速度不同，这样，结构上只有微小差异的各组分才能得到分离。蛋白质纯化的许多技术，就是利用色谱法（表2-1）。
二、色谱法的特点
1. 具有极高的分辨效力 只要选择好适当的色谱法（色谱类型、色谱条件），就能很好地分离理化性质极为相近的混合物。
2. 具有极高的分析效率 对某一混合组分，只需几十分钟乃至几分钟就可完成一个分析周期。如用高效薄层色谱（high performance thin layer liquid chromatography，HPTLC）一次仅10 分钟就可完成40 个样品的点样和分析工作。
3. 具有极高的灵敏度 样品组分含量仅数微克，或不足1μg 都可进行很好的分析。现代的气相色谱仪由于使用了高灵敏的检测器，可检出1×10？13～1×10？11g 的样品组分。
4. 操作简便，应用广泛 它广泛地应用于工农业、化学、化工、医药卫生、环境保护、大气监测等各个方面，是现代实验室中常用的分析手段之一。
表2-1 蛋白质的纯化技术
当然，色谱法也有它的局限性：①在定量分析中需要纯制的标准物质；②不能精确地解决物质的化学结构问题。
第二节 常用的色谱方法
一、吸附色谱
吸附色谱（absorption chromatography）是指混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附力，从而不同组分随流动相移动的速度不同，*终可将混合物中不同组分分离的方法。这种分离方法取决于待分离物质被吸附剂固定相所吸附的能力，以及它们在分离时所用的溶剂流动相中的溶解度这两个方面的差异。根据操作方式不同，吸附色谱可分为柱色谱（column chromatography）和薄层色谱（thin layer chromatography）两种。
（一）柱色谱
在柱吸附色谱中，混合物的分离是在装有适当吸附剂的玻璃管柱中进行的，色谱柱下端铺垫棉花或玻璃棉，柱内充填溶剂湿润的吸附剂，待分离样品自柱顶部加入，样品完全进入吸附柱后，再用适当的溶液（洗脱液）洗脱。假如待分离的样品内含有A、B 两种成分，在洗脱过程中随着流动相流经固定相，它们在柱内分别连续地产生溶解、吸附、再溶解的现象。由于洗脱液和吸附剂对A、B 的溶解力与吸附力不同，A、B 在柱内移动的速率也不同。溶解度大而吸附力小的物质走在前面，相反，溶解度小而吸附力大的物质走在后面。经过一段时间以后，A、B 两种物质可在柱的不同区域各自形成环带。如A、B 为有色物质，就可以看到不同的色层，每个色带就是一种纯物质。然后继续用洗脱液洗脱，分段收集，直到各组分按顺序先后完全从柱中洗出为止。
（二）薄层色谱
薄层色谱利用的方法是把吸附剂均匀地铺在玻璃板或塑料膜上形成薄层，将待分离的样品点在薄层一端，在密闭容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开，由于吸附剂对不同物质吸附力大小不同，因此当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，易被吸附的物质相对移动较慢，较难吸附的物质则相对地移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质就被彼此分开，*后形成互相分离的斑点。
薄层色谱的特点是：①灵敏度高，可检出微量物质；②分离能力强，斑点集中；③展开时间短；④操作简便，适于很多微量样品分离鉴定。
（三）常用的吸附剂
色谱用吸附剂应满足两个要求：一是要有较大的吸附表面和一定的吸附能力，对不同的物质吸附力不同，而且不能与被吸附的物质及洗脱液（或展开剂）发生反应：二是吸附剂粒度大小适中，不宜过粗（展开太快，分离效果差），也不宜太细（展开过慢，斑点易于扩散）。一般来说，薄层色谱所用吸附剂的粒度较细，如硅胶要求200 目左右。
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等。
（四）洗脱液（展开剂）
不论是柱色谱还是薄层色谱，在选择洗脱液或展开剂时应符合以下条件：①一般应使用比较纯的试剂，含有杂质常会影响洗脱能力；②与样品、吸附剂不发生化学反应；③能溶解样品中的各成分；④黏度小、流动性好，不致洗脱或展开太慢；⑤容易与所要分离的成分分开。
选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、洗脱液及被分离物质三方面考虑，一般用亲水性吸附剂（如硅胶、氧化铝）作色谱分离时，若被测组分极性较大，应选用吸附性较强（活动较低）的吸附剂，用极性较大的洗脱液或展开剂；若被测组分亲脂性较强，应选用较强（活动较高）的吸附剂及极性较小的洗脱液或展开剂。常用洗脱液或展开剂极性递增的次序是：石油醚＜环己烯＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜氯仿＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。
二、分配色谱
分配色谱（partition chromatography）是利用混合物在两种
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