猪功能基因研究

序
前言
1  猪重要经济性状候选基因研究进展
  1.1  繁殖性状候选基因研究进展
    1.1.1  雌激素受体基因
    1.1.2  卵泡刺激素基因
    1.1.3  促黄体素基因
    1.1.4  骨形态发生蛋白基因
    1.1.5  促性腺激素释放激素及其受体基因
    1.1.6  促红细胞生成素受体
    1.1.7  骨桥蛋白基因
    1.1.8  谷胱甘肽硫转移酶M2亚型基因
    1.1.9  TGF-β1基因
    1.1.10  催乳素受体基因
    1.1.11  视黄醇结合蛋白4基因
    1.1.12  视黄酸受体基因
    1.1.13视黄素X受体基因
    1.1.14  甲状腺素运载蛋白基因
  1.2  脂肪性状候选基因研究进展
    1.2.1  肝细胞核因子-4α基因
    1.2.2  肝X受体基因
    1.2.3  Krox20基因
    1.2.4  脂蛋白脂肪酶基因
    1.2.5  脂肪酸结合蛋白基因
    1.2.6  肥胖基因
    1.2.7  激素敏感脂肪酶基因
  1.3  肉质性状候选基因研究进展
    1.3.1  腺苷一磷酸脱氨酶基因
    1.3.2  腺苷琥珀酸裂解酶基因
    1.3.3  氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶／次黄嘌呤核苷酸环水解酶基因
    1.3.4  谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶基因
    1.3.5  钙蛋白酶基因
    1.3.6  半胱氨酸蛋白酶抑制剂B基因
  1.4  肌肉生长性状候选基因研究进展
    1.4.1  生肌调节因子家族
    1.4.2  肌细胞增强因子2家族
    1.4.3  肌肉生长抑制素基因
    1.4.4  I型兰尼定受体基因
  1.5  抗逆性状候选基因研究进展
    1.5.1  抗黏液病毒基因
    1.5.2  天然抗性巨噬蛋白l基因
    1.5.3  唾液酸合成酶基因
    1.5.4  Toll样受体家族
    1.5.5  冷诱导RNA结合蛋白基因
    1.5.6  Y-box结合蛋白-1基因
  1.6  体长性状候选基因研究进展
    1.6.1  多形性腺瘤基因
    1.6.2  生殖细胞核因子
    1.6.3  配体依赖的核受体辅阻遏物
2  猪基因克隆与序列分析
  2.1  材料与方法
    2.1.1  实验动物组织样
    2.1.2  菌株和克隆载体
    2.1.3  主要仪器设备
    2.1.4  主要药品和酶
    2.1.5  缓冲液及主要溶液的配制
    2.1.6  DNA的提取与检测
    2.1.7  组织总RNA的提取与检测
    2.1.8  引物设计与合成
    2.1.9  cDNA克隆
    2.1.10  基因组DNA克隆
    2.1.11  主要分子生物学软件及统计分析软件
  2.2  结果与分析
    2.2.1  HNF-4α基因克隆与序列分析
    2.2.2  LXRα基因克隆与序列分析
    2.2.3  RXRα基因克隆与序列分析
    2.2.4  MEF2A基因克隆及序列分析
    2.2.5  CstB基因克隆与序列分析
    2.2.6  RPS3基因克隆与序列分析
    2.2.7  OPN基因克隆与序列分析
    2.2.8  EPOR基因克隆与序列分析
    2.2.9  GnRt丁及其受体基因克隆与序列分析
    2.2.10  长白猪ADSL基因克隆与序列分析
    2.2.11  长白猪PurH基因克隆与序列分析
    2.2.12  民猪GPAT基因克隆与序列分析
    2.2.13  民猪MyoG基因克隆与序列分析
    2.2.14  SRPK1／3基因克隆与序列分析
    2.2.15  BMP-6基因克隆与序列分析
    2.2.16  IGFBP7基因克隆与序列分析
    2.2.17  CIRP基因克隆与序列分析
    2.2.18  PDZRN3基因克隆与序列分析
    2.2.19  COX1基因克隆与序列分析
    2.2.20  NANS基因克隆与序列分析
    2.2.21  NLJMB基因克隆与序列分析
    2.2.22  IgG重链基因克隆与序列分析
    2.2.23  IRG6基因克隆与序列分析
    2.2.24  OAS1基因克隆与序列分析
    2.2.25  YB1基因克隆与序列分析
  2.3  讨论
    2.3.1  关于取样、RNA提取和反转录反应
    2.3.2  cDNA克隆
    2.3.3  基因组DNA部分片段克隆
3  猪基因表达规律研究
  3.1  材料与方法
    3.1.1  实验动物组织样
    3.1.2  主要仪器设备
    3.1.3  总RNA的提取与检测
    3.1.4  引物设计与合成
    3.1.5  反转录反应
    3.1.6  线性增长试验
    3.1.7  PCR扩增
    3.1.8  琼脂糖凝胶电泳检测
    3.1.9  竞争性RT-PCR
    3.1.10  Real-time PCR反应
    3.1.11  数据分析
  3.2  结果与分析
    3.2.1  RBP4基因的时空转录情况
    3.2.2  RAR基因的时空转录情况
    3.2.3  RXR基因的时空转录情况
    3.2.4  TTR基因的时空转录情况
    3.2.5  HNF-4α基因的转录情况
    3.2.6  LXRa基因的时空转录情况
    3.2.7  OPN基因的时空转录情况
    3.2.8  MEf2基因的转录分析
    3.2.9  EGR2及其调控相关基因的转录情况检测
    3.2.10  MC3及基因的转录分析
    3.2.11  CstB基因的时空转录分析
    3.2.12  LPL基因的时空转录分析
    3.2.13  SRPK1／3基因的时空转录分析
    3.2.14  BMP-6基因的定量检测
    3.2.15  IGFBP7基因的定量检测
  3.3  讨论
    3.3.1  相对定量RT-PCR分析
    3.3.2  竞争胜RT-PCR分析
    3.3.3  Real-time PCR分析
4  猪基因单核苷酸多态性分析
  4.1  实验方法
    4.1.1  实验动物组织样
    4.1.2  药品和酶
    4.1.3  主要仪器设备
    4.1.4  基因组DNA的提取与检测
    4.1.5  引物设计与合成
    4.1.6  PCR_SSCP检测
    4.1.7  基因多态性的统计方法
  4.2  结果与分析
    4.2.1  EGR2基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.2  HNF-4α基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.3  ADSL基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.4  PurH基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.5  GPAT基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.6  SRPK1／3基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.7  GSTM2基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.8  TGF-β1基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.9  BMP-6基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.10  GnRHR基因的单核苷酸多态性分析
    4.2.11  TLR4基因的多态性分析
    4.2.12  PLAG1基因多态性分析
    4.2.13  NR6A1基因多态性分析
    4.2.14  LCORL基因多态性分析
  4.3  讨论
    4.3.1  基因组DNA提取
    4.3.2  PCR-SSCP多态性分析
5  猪基因功能分析
  5.1  实验方法
    5.1.1  缓冲液及主要试剂的配制
    5.1.2  引物的设计与合成
    5.1.3  细胞培养
    5.1.4  RNA干扰
    5.1.5  过量表达
    5.1.6  荧光素酶活性测定
    5.1.7  数据统计分析
    5.1.8  生物信息学分析
  5.2  结果与分析
    5.2.1  Krox20对脂肪细胞的影响
    5.2.2  Smad3、GDF8和MyoD对猪骨骼肌卫星细胞的影响及互作
    5.2.3  民猪MyoG基因启动子核心区定位
    5.2.4  民猪CYP1A1基因启动子核心区定位
    5.2.5  民猪MC4R基因启动子核心区定位
    5.2.6  民猪FST基因启动子核心区定位
  5.3  讨论
    5.3.1  shRNA的设计与筛选
    5.3.2  前体脂肪细胞体外培养
    5.3.3  骨骼肌卫星细胞培养及鉴定
    5.3.4  转染效率的影响因素
    5.3.5  Krox20对猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响_
    5.3.6  Smad3、MyoD与GDF-8对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响
    5.3.7  Smad3、MyoD与GDF-8在骨骼肌卫星细胞增殖过程中的调控网络关系
    5.3.8  MyoG基因启动子区域生物信息学分析
    5.3.9  MyoG基因启动子活性分析
    5.3.10  CYP1A1基因启动子活性分析
    5.3.11  MC4R基因启动子活性分析
6  猪基因组织特异性表达分析
  6.1  材料与方法
    6.1.1  载体与菌株
    6.1.2  MC4R特异表达载体的构建与表达
    6.1.3  FST基因特异表达载体的构建与表达
  6.2  结果与分析
    6.2.1   MC4R基因特异表达载体的构建与表达
    6.2.2   FST基因特异表达载体的构建与表达
  6.3  讨论
    6.3.1  MC4R-P1／P2重组质粒的构建
    6.3.2  FST-P1、FST-P2重组质粒的构建
    6.3.3  FST-P3、FST-P4重组质粒的构建
    6.3.4  Tet-On系统的优点
    6.3.5  瞬时转染后细胞状态的观察
    6.3.6  诱导表达基因的检测
    6.3.7  诱导MC4R基因对CMS系统的影响
    6.3.8  FST与MyoD、MyoG、MSTN、GDF11之间的互作分析
7  高通量测序分析猪差异表达基因
  7.1  材料与方法
    7.1.1  实验材料与测序
    7.1.2  数据整理与分析
  7.2  结果与分析
    7.2.1  测序质量评估
    7.2.2  clean tag拷贝数分布统计
    7.2.3  clearn tag比对统计
    7.2.4  差异表达基因及部分功能基因的表达
    7.2.5  反义转录本与新转录本预测结果
    7.2.6  GO功能显著性富集分析
    7.2.7  Pathway显著性富集分析
    7.2.8  测序饱和度分析
  7.3  讨论
    7.3.1  高通量测序数据的初步分析
    7.3.2  部分差显基因或转录子的表达分析
    7.3.3  GO和Pathway分析
参考文献
附录
  附录一 本研究中获得的GenBank登录号
  附录二 本研究涉及的学位论文
  附录三 差异倍数在2倍以上的上调差异基因
  附录四 差异倍数在2倍以上的下调差异基因
  附录五 彩色插图
  附录六 本研究涉及的猪种
  附录七 参编人员