我国野生披碱草属牧草遗传多样性研究

本专著是以我国12个省（区）的12种披碱草属牧草的105个野生居群为对象，对披碱草属牧草进行形态学多样性、染色体多样性、ISSR分子标记和ITS基因序列多样性等方面研究，对研究结果进行深入分析讨论的基础上探讨和揭示披碱草属牧草的遗传多样性。 

德英（1978-），女（达斡尔族），内蒙古呼伦贝尔市人，副研究员，主要从事牧草资源与育种研究，主持完成项目4项，参加20余项，完成获发明专利1项和实用新型专利3项；第五完成人审定登记育成品种1个；主编著作2部，第3主著2部；作者发表论文12篇，获国家科技进步二等奖1项（二级证书）。 

前言
披碱草属（Elymus L）是禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）重要的一个属，按《中国植物志》记载，我国有12个野生种，多数是草原和草甸的重要组成成分，具有较高的饲用价值。
因地域辽阔，自然环境极其复杂，我国披碱草属牧草种质资源非常丰富，是我国发展草地畜牧业的重要物质基础，具有广阔的研究和利用前景。近年来，我国基本完成了一些重点与典型地区的披碱草属牧草种质资源考察和部分种质的采集工作，基本摸清了这些地区的披碱草属牧草种质资源现状与家底，但因起步晚、物力、财力和人力的不足，收集的种质很多未能及时进行相应的鉴定、评价、筛选等深入研究，尤其对披碱草属牧草种质资源遗传多样性、种质创新、基因挖掘等研究乏力。所以，在继续搜集我国披碱草属牧草种质资源的情况下，一方面应逐步开展披碱草属牧草种内的系统鉴定和筛选；另一方面应重点加强其遗传多样性、遗传分化机理等方面的深入研究，为合理保护、高效利用提供依据。
笔者在同一试验条件下，对我国105份野生披碱草属牧草进行了穗部多样性研究，针对属内的重点草种老芒麦(Esibiricus)和垂穗披碱草(Enutans)进行了形态学多样性和主要农艺性状研究；对我国野生12种披碱草属牧草进行了染色体核型分析，同时进行了RAPD遗传多样性分析；对老芒麦种质进行了染色体核型分析；老芒麦和垂穗披碱草进行了ISSR和ITS序列分析。获得主要结果如下：
（1）我国野生披碱草属牧草居群的遗传多样性主要集中在居群内部（7211％），居群间的遗传变异较小（2789％），我国西北部是野生披碱草属牧草的分布中心，也是披碱草属牧草的遗传多样性中心。穗部性状指标的平均变异系数为3122％，的颖芒长的变异系数为58932%，其次为旗叶与穗基部长度的变异系数为56683%，小的外稃长为14908%。居群总多样性指数的为小穗长（2054）；其次是穗长(2049)，的为小花数(1404)，居群内多样性指数的为旗叶与穗基部长（1648）；其次是小穗数（1638），的为小花数（0671）。
（2）老芒麦和垂穗披碱草种间差异显著，二者在种内也有显著差异，且种间的差异大于种内，表现出较为丰富的表型多样性。老芒麦表型分化的主要指标有12个，垂穗披碱草表型分化的主要指标有11个，分化的主要指标中有9个相同，株高和小穗数是老芒麦和垂穗披碱草主要的两个表型分化指标。
（3）老芒麦生育期差异大于垂穗披碱草，在整个生长期内，老芒麦从分蘖期到孕穗期株高变化幅度，而垂穗披碱草株高变化幅度是从分蘖期到开花期；老芒麦和垂穗披碱草叶面积指标变化快的时期都是分蘖期到拔节期。在完熟期，来自高海拔地区的老芒麦株高都大于低海拔地区，高纬度地区的垂穗披碱草植株都矮于来自低纬度地区的；高纬度地区的老芒麦叶面积大于来自低纬度地区，而高海拔地区的垂穗披碱草叶面积大于来自低海拔地区。老芒麦中以晚熟材料居多，而垂穗披碱草以早熟材料居多，晚熟材料表现为植株较矮，叶面积较大，分蘖数较多；而早熟型材料则表现为植株高大，叶面积较小，分蘖数较少。
（4）垂穗披碱草的鲜干比大于老芒麦，所有供试材料中ES018和EN004的鲜干比，营养较丰富；来自高海拔地区的老芒麦单穗重都比较小；通过综合比较，ES010、ES011、ES014、ES021、ES024、EN010、EN011、EN015的穗茎干重、分蘖数以及单穗重等表现好，在生产中可优先利用。ES031可作为培育早熟品种的原始材料深入研究。
（5）我国12种野生披碱草属牧草核型分析，结果表明它们染色体基数为7，数目分别2n=28、2n=42和2n=56，其中老芒麦为四倍体，2n=4x=28，无芒披碱草为八倍体，2n=8x=56，其余10种均为六倍体。染色体主要由中部着丝粒(m)和近中着丝粒(sm)染色体组成。平均臂比介于1317～1511。其核型类型分 2B、2A、1B、1A 四种类型。核型进化由高到低依次为：2B［老芒麦、披碱草（Elymusdahuricus）、青紫披碱草（Edahuricus varvioleus）］ >2A［无芒披碱草（Esubmuticus）、黑紫披碱草（Eatratus）、肥披碱草（Eexcelsus）、毛披碱草（Evillifer）］ >1B［垂穗披碱草、麦薲草（Etangutorum）、圆柱披碱草（Ecylindricus）、紫芒披碱草（Epurpuraristatus）］ >1A［短芒披碱草（Ebreviaristatus）］ 。
我国12种野生披碱草属牧草的核型似近系数(λ)范围为0994～0863，其中披碱草与青紫披碱草的核型似近系数，亲缘关系十分密切。聚类分析可分为两类，类老芒麦；第二类分为两组，组为披碱草、青紫披碱草、黑紫披碱草、肥披碱草、无芒披碱草、毛披碱草和短芒披碱草，第二组为垂穗披碱草、麦薲草、圆柱披碱草和紫芒披碱草。根据核型似近系数进行的聚类分析，能够体现披碱草属种间的亲缘关系。其聚类结果明显地按照核型类型分类，且与形态分类部分吻合。
（6）4份老芒麦染色体核型公式均不同，类型包括1B和2B，染色体组长度变异范围13444～3850μm，相对长度变异范围10975%～4040%，平均相对长度变异范围为7143%，核型不对称系数变异范围为60140%～58390%；相互间的核型似近系数范围是0994～0913，平均为0955，即同一物种染色体同源性较高。
（7）30条有效引物对我国野生12种披碱草属牧草种间材料进行RAPD分析，其遗传一致性变异范围为07514～04859；披碱草和青紫披碱草的亲缘关系近。利用遗传一致性进行聚类分析，可分为两类，即：类为老芒麦；第二类分为两组，组为短芒披碱草、无芒披碱草、垂穗披碱草和黑紫披碱草；第二组为披碱草、青紫披碱草、肥披碱草、麦宾草、圆柱披碱草、紫芒披碱草和毛披碱草。聚类结果与形态分类基本一致。
（8）老芒麦和垂穗披碱草ISSR-PCR反应化体系为：25 μL反应体系中，25 μL 10×buffer（不含Mg2 ），TaqDNA聚合酶10 U，Mg2 20mmol/L，模板DNA 30～120 ng，NTPs 025mmol/L，引物025 μmol/L；扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性1min，51℃退火1min（根据引物而定），72℃延伸15min，共41个循环，72℃后延伸10min，扩增完后4℃保存。
12条引物对31份老芒麦和19份垂穗披碱草进行扩增，共检测出111条谱带，有107条多态性谱带，多态性比例达到了9640%，50份材料总的有效等位基因数Ne为1552，Neis基因多样性指数为0304，Shannon指数为0459，31份老芒麦的ISSR多态性片段比例为9279%，有效等位基因数Ne为1442，Neis基因多样性指数为0273，Shannon指数为0424，19份垂穗披碱草的多态性为8468%，有效等位基因数Ne、Neis基因多样性指数和Shannon指数分别为1433、0263、0403，不同老芒麦材料间的遗传差异大于垂穗披碱草。
（9）老芒麦和垂穗披碱草进行ITS多序列比对，发现4个有明显种性变异的位点，分别是100位碱基垂穗披碱草为T，老芒麦为C；195位碱基垂穗披碱草为A，老芒麦为G；438位碱基垂穗披碱草为A，老芒麦为C；547位碱基垂穗披碱草为A，老芒麦为C。
此项研究受到中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国农业科学院草原研究所）资助项目（2008-Z-1）、国家自然科技资源共享平台“牧草植物种质资源标准化整理、整合及共享试点（2005DKA21007）”、中国农业科学院草原研究所草遗传资源与育种创新团队的资助。
虽然笔者在本书撰写过程中认真严谨，但由于水平有限，书中难免有不足之处，敬请读者批评指正！

德英2018年10月

章披碱草属牧草概述
节披碱草属牧草的重要性及其种类多样性
一、披碱草属牧草的重要性
披碱草属牧草（Elymus L）为禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）中重要的一个属，遗传和物种多样性较为丰富的类群之一。自20世纪70年代以来，在我国北方温带干旱地区广泛种植，面积逐年扩大。肥披碱草（Elymus excelsus）、披碱草（Edahuricus）、老芒麦（Esibiricus）已在东北、华北、西北等地驯化栽培，并成为这些地区建立人工草地的主要牧草。披碱草属牧草适应性强、品质优良、草产量及种子产量高，抗寒耐牧性较强，不少种类是放牧和刈割兼用的野生优良牧草。该属中的许多野生种，均含有抗普通栽培小麦和大麦的一些病虫害和抗逆的基因，如抗大麦黄矮病、抗小麦花叶病、抗大麦锈病等，并且这些基因能通过现代遗传和生物技术的方法从野生种类中转移到栽培小麦和大麦的遗传背景中来。因此，作为丰富麦类作物和牧草遗传多样性的基因资源库，具有重要的经济价值。目前加强牧草种质资源的有效保护和合理利用逐渐得到重视，在我国批准的国家重点保护野生植物名录中禾本科有15种，其中短芒披碱草（Elymus breviaristatus）、无芒披碱草（Esubmuticus）和毛披碱草（Evillifer）均属于国家二级保护植物，开展披碱草属牧草种质资源保存和创新对保护珍稀、濒危生物资源，保护生物多样性有着积极的作用和意义。
披碱草属牧草种质资源是披碱草属牧草及近缘作物新品种选育、遗传理论研究、生物技术研究和农业生产的重要物质基础，世界上许多国家十分重视对该属牧草种质资源的广泛收集、交换、研究和开发利用，国内外新选育出的披碱草属牧草新品种在改良和草业生产方面都发挥着重要作用。披碱草属牧草也是人类在研究多倍体物种形成途径和进化机制时比较好的研究材料。
二、披碱草属牧草的分类学研究
自1753年林奈建立披碱草属（Elymus L）以来，其分属界限发生过多次大的变动，不同的分属界限存在很大差异。按照历史上不同分类学家的处理，披碱草属曾经包含了冰草属（Agropyron）、猬草属（Hystrix）、带芒草属（Taeniatherum）、鹅观草属（Roegneria）、赖草属（Leymus）和偃麦草属（Elytrigia）。Nevski 将该属处理为只包含20～30个物种的小属，三本较大的欧亚植物志著作——《苏联禾本科》《中国主要植物图说——禾本科》和《欧洲植物志》均一致同意 Nevski 的处理。不同时期学者对该属形态特征的界定范围存在较大分歧，关于披碱草属的分类系统，目前争议是将鹅观草属、猬草属和披碱草属合并为1个属，即披碱草属（广义），还是将其划分为3个独立的属。Bentham和Nevski等的北美和欧洲的一些学者，特别是Dewey和Lve以染色体组为分类依据，认为形态特征在披碱草属的界定上不太重要，他们不考虑每一穗节的小穗数量而支持广义的披碱草属分类方法，把鹅观草属、猬草属归于披碱草属之中。有不少学者，特别是我国的禾草学家则主张将鹅观草属、猬草属从披碱草属中独立出来，这种分类系统主要依据穗部的形态特征。《中国植物志》记载我国有13个种，包括12个野生种（含1变种）和1个引进种；《中国禾草属志》记载的披碱草属不含鹅观草属、冰草属以及猬草属等，全世界共含有150多个种，其中我国有12种；《中国饲用植物》则认为我国披碱草属牧草有13种，与《中国植物志》相同。按照广义的披碱草属概念，英文版《中国植物志》（Flora of China）记载的披碱草属植物约170种，并载入了在中国分布的88种，其中包括《中国植物志》中鹅观草属植物59种，是目前国际上为通用的概念；而根据狭义的披碱草属概念，我国仅有12个物种。
三、我国野生披碱草属牧草
1种类及其分布
披碱草属牧草广泛分布在南、北半球温带地区，在我国主要分布于西南及北方山地。披碱草属内各种间形态差异较大，根据狭义的披碱草属概念，我国有12个野生种（含1变种），种名及其分布如下：
（1）黑紫披碱草［Elymus atratus（Nevski）Hand-Mazz］，分布于四川、青海、甘肃、新疆维吾尔自治区（全书简称新疆）、西藏自治区（全书简称西藏）等省区，多生于草原上。
（2）短芒披碱草［Elymus breviaristatus (Keng）Keng f］，分布于四川、青海等省，生于山坡上。
（3）圆柱披碱草［Elymus cylindricus（Franch）Handa］，分布于内蒙古自治区（全书简称内蒙古）、河北、四川、青海、新疆等省区，生于草原化草甸、河谷草甸、山坡、林缘草甸、田野和路旁。
（4）披碱草（Elymus dahuricus Turcz），分布于东北、华北、西北各省区，生于河谷草甸、沼泽化草甸、芨芨草盐化草甸。
（5）青紫披碱草（Elymus dahuricus Turczvarvioleus CPWang etHLYang），分布于内蒙古大青山、青海等地，生于山沟、山坡、草地以及沟谷草甸。
（6）肥披碱草（Elymus excelsus Turcz），分布于东北、内蒙古、甘肃、四川、青海、新疆，生于森林草原和草原带的山地草甸和草甸草原中。
（7）垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb），分布于内蒙古、河北、宁夏回族自治区（全书简称宁夏）、陕西、甘肃、青海、四川、新疆和西藏等省区，生于河边湿地、沙地、林下、林缘和草甸中。
（8）紫芒披碱草（Elymus purpuraristatus CPWang etHLYang），分布于内蒙古大青山、蛮汗山，生于山沟、山坡草地。
（9）老芒麦（Elymus sibiricus L），分布于东北、华北、甘肃、新疆、青海、西藏南部、华东、西南，生于森林草原的河谷草甸、山地草甸化草原、疏林、灌丛和林间空地。
（10）无芒披碱草［Elymus submuticus (Keng）Keng f］，特产于四川省，生于山坡。
（11）麦薲草［Elymus tangutorum (Nevski）Hand-Mazz］，分布于内蒙古、山西、甘肃、青海、四川、新疆、西藏等省区，生于山坡、草地。
（12）毛披碱草（Elymus villifer CPWang etHLYang），产内蒙古大青山，生于山地沟谷草甸。
2老芒麦和垂穗披碱草种质资源
（1）老芒麦种质资源。
老芒麦（Elymus sibiricus L）是禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）披碱草属（Elymus L）多年生草本，是该属模式种，别名西伯利亚野麦草、垂穗大麦草、西伯利亚披碱草。老芒麦是北半球温带地区分布较广的一种野生牧草，是欧亚大陆的广布种，是草甸草原和草甸群落中的重要成员之一。
我国早于20世纪50年代开始在吉林驯化，至20世纪60年代在生产上陆续推广应用。截至2013年，我国通过全国草品种审定委员会审定登记的老芒麦品种有以下8个，分别是川草1号老芒麦、川草2号老芒麦、吉林老芒麦、农牧老芒麦、青牧1号老芒麦、阿坝老芒麦、同德老芒麦以及康巴老芒麦。
老芒麦耐寒耐低温能力强，在-40～-30℃的低温以及海拔4 000m以上的高原地区能安全越冬，在海拔5 200m以上的喜马拉雅山区也有一定的分布；抗旱性较强，在年降水量400～600mm的地区可旱作栽培，但在干旱地区种植则要有灌溉条件。对土壤的适应性较广，在瘠薄、弱酸、微碱或含腐殖质较高的土壤中均生长良好。粗蛋白质含量高、植株无味，适口性好，马、牛、羊均喜食。
（2）垂穗披碱草种质资源。
垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb）是禾本科(Gramineae)小麦族（Triticeae）披碱草属（Elymus L）多年生草本，又名弯穗草、钩头草。垂穗披碱草是草甸草原和草甸群落中的重要成分，在海拔2 500～4 000m的青藏高原高寒湿润地区常作为建群种。
垂穗披碱草从20世纪60年代开始在我国西北地区种植，并逐步进行试种、栽培以及研究，截至2009年，我国通过全国草品种审定委员会审定登记的垂穗披碱草品种有甘南垂穗披碱草、康巴垂穗披碱草以及阿坝垂穗披碱草。
垂穗披碱草具有较强的低温生长及抗寒能力，抗旱性强，粗蛋白质含量高、适口性好，能适应各种不同类型的土壤，具有广泛的生长可塑性，在平原、高原、平滩以及山地阳坡、沟谷、半阴坡山麓地带到灌丛草甸和高山草甸均能生长，目前在我国西北高寒、湿润地区栽培居多。开花期前垂穗披碱草质地柔软，无刚毛、刺毛，无异味，牛、马、羊所喜食。
（3）二者差异性。
老芒麦和垂穗披碱草是披碱草属中重要的两种多年生牧草，具有披碱草属牧草的优点，但又各有优势，它们在生产中都主要用于建立人工草地。老芒麦饲用价值较大，粗蛋白质含量比垂穗披碱草高，分蘖能力也高于垂穗披碱草。然而，垂穗披碱草抗旱性高于老芒麦，侵占性强，已成为水土保持，改善生态环境条件必不可少的优良野生牧草，抗寒能力强于老芒麦，对高海拔地区的自然条件适应能力特好，耐牧耐践踏能力也高于老芒麦。
老芒麦和垂穗披碱草是我国常见的两种穗下垂型披碱草属牧草，在形态上较为相似，二者的生态幅都比较宽。在长期适应自然环境的过程中，不同地区以及不同生境材料的遗传特征均会发生变异，尤其是表型性状容易受环境的影响，从而使得在分类学上鉴定时存在一定的困难。按照传统的分类学方法，对它们的识别和鉴定主要是通过花序的形态、穗轴上小穗的着生数目、颖先端有无具芒以及所具芒的形态来进行的，然而在实际野外调查中，尤其在高海拔地区以及某些特殊的小生境中，两个种在形态上的交叉现象比较严重，将它们准确分类往往较困难，因此常常存在着对老芒麦和垂穗披碱草错误鉴定的现象。
第二节我国野生披碱草属牧草种质资源的搜集
披碱草属牧草种质资源是重要的禾本科小麦族牧草，具有重要的饲用与生态价值，我国野生披碱草属牧草种质资源相当丰富，然而对它们尚未充分搜集、保存和评价利用。在2006年时，以入国家长期库保存为例，入库 10 个种，保存份数才有 173 份，其中老芒麦多，有 92 份，其次为披碱草 32 份、圆柱披碱草 16 份、垂穗披碱草 13 份、麦薲草 10 份，其他种只有几份；入国家牧草中期库保存的披碱草属牧草种类数还不如国家长期库多。
因此，2006—2008年期间，在国家自然科技资源共享平台“牧草植物种质资源标准化整理、整合及共享试点（2005DKA21007）”项目的资助下，项目组人员分别对新疆、四川、青海、内蒙古、东北等地区的披碱草属牧草种质资通过路线式及点、线、面相结合的方式进行考察和采集，共采集到211份披碱草属牧草种质资源，基本涵盖了披碱草属牧草种质资源的分布地区。
经植物分类学鉴定，隶属于《中国植物志》中记载的12种，详见表1；名录见附表1-12。其中，黑紫披碱草3份，短芒披碱草4份，圆柱披碱草18份，披碱草34份，青紫披碱草2份，肥披碱草19份，垂穗披碱草51份，紫芒披碱草1份，老芒麦66份，无芒披碱草1份，麦薲草10份，毛披碱草2份。
表1我国野生披碱草属牧草种质资源的采集情况

中名学名采集情况采集地区采集种子（份数）资料来源黑紫披碱草Elymus atratus已采到新疆、青海3中国植物志短芒披碱草Ebreviaristatus已采到青海、四川4中国植物志圆柱披碱草Ecylindricus已采到青海、甘肃、四川、内蒙古、新疆18中国植物志披碱草Edahuricus已采到新疆、青海、河北、内蒙古、山西34中国植物志青紫披碱草Edahuricus varvioleus已采到四川、内蒙古2中国植物志肥披碱草Eexcelsus已采到黑龙江、内蒙古、吉林19中国植物志垂穗披碱草Enutans已采到四川、青海、内蒙古、新疆、甘肃、西藏51中国植物志紫芒披碱草Epurpuraristatus已采到内蒙古1中国植物志老芒麦Esibiricus已采到内蒙古、新疆、青海、四川、黑龙江、吉林、陕西、山西、河北66中国植物志无芒披碱草Esubmuticus已采到四川1中国植物志麦薲草Etangutorum已采到内蒙古、青海、四川10中国植物志毛披碱草Evillifer已采到内蒙古2中国植物志合计211