医学微生物学实验与学习指导

本教材配合《医学微生物学》理论教学，为八年制医学生的医学微生物实验课程提供系统的指导。除了细菌学、病毒学、真菌学的常规实验，例如显微镜使用、无菌操作、切片观察、染色鉴定、生化鉴定、药敏鉴定、病毒滴度测定等，还引入了创新性实验，包括基于生物芯片的微生物鉴定，以及一贯式学生自主设计微生物鉴定实验。兼顾基础和创新。 

本教材主要分为实验和附录两部分，实验包括四个部分：细菌学实验、病毒学实验、真菌学实验和综合性实验。每个实验包括目的要求、内容提要、实验材料、实验原理、实验内容和注意事项等条目。附录包括常用培养基和染色液的配制方法。同时本书精选了大量生动清晰、来源于教学实践的示教图片，供学生们实验时参考。
本教材适于医学院校各专业的本、专科生使用。

作者谢兰，清华大学医学院基础医学系讲师。主要从事医学微生物学、人体胚胎学与发育生物学、病理生理学等基础医学学科教学，教龄6年。发表教学论文5篇，主持教学基金2项，其中包括清华大学本科教改立项项目《医学微生物实验指导》。

部分　细菌学实验 1实验一　显微镜的使用 3实验二　细菌的基本形态观察 5实验三　细菌的特殊结构观察 9实验四　常见培养基的配制  13实验五　细菌的分离与纯培养  17实验六　细菌的生长情况观察  22实验七　微生物的计数方法  24实验八　微生物的控制  27实验九　细菌的普通染色  30实验十　细菌的革兰染色  32实验十一　抗酸染色  35实验十二　细菌的生化鉴定  37实验十三　细菌的药敏鉴定  40实验十四　细菌的变异观察  43实验十五　细菌的致病物质检测  44实验十六　细菌的内毒素检测（鲎试验）  45实验十七　细菌的外毒素检测  46实验十八　细菌的血清学鉴定（凝集试验）  48实验十九　荚膜肿胀试验  50实验二十　细菌的核酸提取  51实验二十一　细菌的质粒提取  53实验二十二　细菌的 PCR方法鉴定  55

第二部分　病毒学实验  57实验一　痘苗病毒
MVTT-GFP的接种和滴度测定  59实验二　 MERS-CoV假病毒的中和试验  61实验三　寨卡病毒的分离和鉴定  64实验四　寨卡病毒的分离培养——组织培养法（细胞传代）  67实验五　 HIV-1感染者体内针对 gp160膜蛋白的血清抗体滴度的
ELISA检测  69实验六　 RT-PCR检测 HIV-1感染者血浆中编码
HIV-1膜蛋白的 RNA  72

第三部分　真菌学实验  75实验一　真菌的形态观察  77实验二　真菌的培养  80实验三　真菌的染色  81实验四　新型隐球菌的墨汁染色  82第四部分　综合性实验  83实验一　葡萄球菌的鉴别实验  85实验二　沙门菌的鉴别实验  88实验三　针对临床八年制学生的实验设计  91实验四　基于微流控芯片的微生物检测  93实验五　基于微阵列芯片的微生物检测  98附录一　常用培养基的配制 102附录二　染色液的配制
110参考文献 111

医学微生物学（ Medical Microbiology）是一门医学基础学科，主要研究与人类疾病有关的病原微生物的形态、结构、代谢活动、遗传和变异、致病机制、机体的抗感染免疫、实验室诊断及特异性预防等。医学微生物学实验是医学微生物学教学的重要组成部分，本书撰写的初衷是为了给清华大学八年制医学实验班的《医学微生物学》理论课提供配套的实验教材，内容既包括医学微生物常用的实验技术，同时又结合八年制临床医学生的特点，设计前沿的、与临床结合的实验课程，培养学生创新的科研能力。经过几年的教学实践，教材内容进一步丰满，除了细菌学、病毒学、真菌学的常规实验，例如显微镜使用、无菌操作、切片观察、染色鉴定、生化鉴定、药敏鉴定、病毒滴度测定等，还引入了多个综合性实验，包括基于生物芯片的微生物鉴定，以及一贯式学生自主设计微生物鉴定实验，特别适合八年制医学生使用。本教材兼顾基础与创新，也适合临床医学、护理、口腔、检验、预防、生物等专业的本、专科学生使用，为医学微生物实验课程提供系统的指导。本书的部分细菌学实验由谢兰、吴婧娇、李雪编写；第二部分病毒学实验由史宣玲编写；第三部分真菌学实验由谢兰编写；第四部分综合性实验由黄国亮和谢兰编写。本书受到张敬仁、张林琦两位教授的指导，衷心感谢。在编写过程中郭开元、王瑞君、王扬、靳翔宇、林雪参与了插图的绘制，十分感谢他们的付出。另外，书中收录的部分示教片来自清华大学医学实验班各届学生的实验作业，一并表示感谢。限于编者水平，难免有疏漏或不妥之处，恳请广大师生在使用过程中批评指正。主编　　　 2018年 4月

2．真菌的菌落特征　和细菌的菌落类似，真菌菌落特征同样包括以下多个方面：形状、大小、颜色、光泽、含水状况、透明度、边缘和隆起等。另外，酿酒酵母等菌落还可具备特殊的气味，可辅助鉴定。【实验步骤】 1．真菌基本形态标本片　酵母菌、青霉菌、面包菌。示教结果：青霉菌：低倍镜下即可见。其菌丝在有性生殖阶段产生多细胞分支；在无性生殖阶段，菌丝则会产生直立的多细胞分生孢子梗。菌体颜色为灰绿色，菌丝排列形态类似草丛，上部是“叶”，为菌丝产生的多分支的孢子梗，下部是“根”，为分布较松散的菌丝。使用高倍镜观察青霉菌的“叶”。可看到每个菌丝分出多个分支，即为分生孢子。分生孢子内有较多黑绿色颗粒物。性状类似扫帚（图 3-1-2A）。酵母菌：该涂片使用三种不同染料，形成了三种不同颜色的酵母菌（图 3-1-2B）。面包菌：包含细长的菌丝和圆形的孢子（图 3-1-2C）。

AB 
C 图 3-1-2　真菌基本形态示教片（彩图附后） 
A．青霉菌； B．酵母菌； C．面包菌 2．真菌的菌落观察　观察酿酒酵母菌、青霉菌、放线菌的菌落平板，并描述菌落的特征。【结果与讨论】 1．选取有代表性的微生物绘制 2幅图片。绘图时需注意大小、形状和排列，按照视野实际大小的 2～5倍描画，每份报告统一放大倍数。颜色深的可以用点的密度来表示。 
2．描述所观察菌落的特征，包括形状、大小、颜色、光泽、含水状况、透明度、边缘状况、气味等。

【目的要求】 1．掌握常见的真菌培养方法。 
2．熟悉常见的真菌培养基。 
3．了解常见菌种的菌落特征。

【内容提要】 1．真菌的培养。 
2．沙氏葡萄糖琼脂培养基的配制。 
3．观察真菌的菌落形态。

【实验材料】 1．菌种　白色念珠菌、新型隐球菌。 
2．标本　皮屑、甲屑或断发。 
3．培养基　沙氏葡萄糖琼脂培养基。 

4．其他　70%乙醇、无菌试管、无菌的生理盐水、无菌镊子、接种针、培养箱、 C形铁环、无菌玻片、平皿、吸管等。【实验原理】真菌培养的方法有大培养法和小培养法两种。大培养法主要用于患者标本的分离培养及菌落特性的观察，常见的培养方法有试管培养法和斜面培养法；小培养法主要用于观察真菌发育过程及形态特点，其优点是可以在显微镜下直接观察，避免取样时破坏菌丝和孢子。小培养的方法有很多，如玻片培养法、回形针培养法、悬滴培养法等。真菌对营养的要求不高，常见的培养基有沙氏葡萄糖琼脂培养基（ SDA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ PDA）、察氏培养基（ CDA）、脑心浸膏琼脂培养基（ BHI）。真菌的菌体形态在不同的培养基中差别很大，为了统一标准，鉴定时统一采用 SDA培养基。【实验步骤】 1．大培养法（大试管培养法）　将皮屑、甲屑或断发标本经 70%乙醇浸泡数分钟以杀死杂菌，并用无菌的生理盐水充分洗涤，再用无菌镊子夹取标本点种于大试管沙氏培养基上。置 25℃培养箱中培养，每日观察生长情况及菌落特征。 2．小培养法（玻片培养法）（1）取一无菌的玻片，中央放置无菌的 C形铁环，开口方向朝向玻片长端，用无菌吸管吸取沙氏培养基少许，加入 C形铁环，待琼脂凝固后，用接种针挑取菌种从开口处接种于培养基上。
（2）盖上无菌盖玻片，放置于平皿中，于 35℃或室温下培养。
（3）待生长后，肉眼观察菌落特征，并可将玻片置于显微镜下观察真菌生长发育及形态特征，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。

【结果与讨论】 1．记录培养菌的每日生长情况及菌落特征，绘制培养菌的菌丝和孢子形态。 
2．描述真菌的培养特性，思考不同的培养方法和培养基适用于哪些类型的真菌？

第三部分　真菌学实验.81
【目的要求】 1．掌握乳酸酚棉蓝染色法。 
2．了解常见菌的菌丝和孢子形态。

【内容提要】 1．乳酸酚棉蓝染色法。 
2．白假丝酵母菌的厚膜孢子鉴定。

【实验材料】 1．菌种　白假丝酵母菌。 
2．培养基　沙氏培养基、玉米粉吐温 .80琼脂培养基。 
3．试剂　乳酸酚棉蓝染色液。 
4．其他　无菌玻片、培养箱、接种针等。

【实验原理】真菌根据致病性可以分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌包括毛癣菌属、小孢子菌属、表皮癣菌属；深部菌属包括假丝酵母菌属、隐球菌属、曲霉菌属。白假丝酵母菌属于深部真菌，通常存在于人的口腔、上呼吸道、阴道和肠道黏膜上，菌体为圆形或卵圆形，有芽生孢子、假菌丝或厚膜孢子。真菌检查的方法有很多，如形态学检查（镜检＋染色）、生化检查、血清检查等。真菌的染色可以采用革兰染色法，和细菌的革兰染色法相同。另外墨汁染色用于新型隐球菌及荚膜的镜检。乳酸酚棉蓝染色法是常用的真菌培养物染色方法，可将真菌的菌丝和孢子染为浅蓝色，本章重点介绍乳酸酚棉蓝染色法。【实验步骤】 1．培养　通过玻片培养法将白假丝酵母菌接种于沙氏培养基中，室温培养 48～72 h，观察菌落特征。 
2．镜检　取洁净载玻片 1片，滴加 1滴乳酸酚棉蓝染色液，将被检标本加入染色液中，加上盖玻片后镜检，观察其菌丝和孢子形态。 
3．厚膜孢子形成试验　通过玻片培养法将白假丝酵母菌接种于玉米粉吐温 .80琼脂培养基中，在 25℃下培养 24～48 h，鉴定有无厚膜孢子形成。

示教结果：乳酸酚棉蓝染色，镜下可观察到该菌被染成浅蓝色，呈圆形或卵圆形，菌体表面可见芽生孢子和假菌丝，出芽孢子呈卵圆形，比葡萄球菌大 2～5倍。厚膜孢子形成实验，在高倍镜下可见圆形、包膜增厚的厚膜孢子（图 3-3-1）。【结果与讨论】 1．假丝酵母菌的鉴定要点是什么？ 
2．镜下观察并绘制该菌的菌丝和孢子形态。

图 3-3-1　白假丝酵母厚膜孢子
【目的要求】 1．掌握新型隐球菌墨汁染色的意义。 
2．掌握墨汁染色法。 
3．了解新型隐球菌的形态。

【内容提要】 1．墨汁染色。 
2．观察隐球菌的荚膜形态。

【实验原理】新型隐球菌（ cryptococcus neoformans）又名溶组织酵母菌（ torula histolytica），是土壤、鸽类、牛乳、水果等的腐生菌，也可存在于人口腔中，可侵犯人和动物，属于条件致病菌。新型隐球菌菌体周围有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，用墨汁负染后镜检，可在黑色背景中见到圆形或卵圆形的透亮菌体，外包透明的荚膜。将脑脊液标本进行墨汁染色镜检找到隐球菌是诊断新型隐球菌性脑炎的金标准。【实验材料】 1．样本　小鼠脑脊液。 
2．试剂　墨汁。 
3．其他　载玻片、吸管、显微镜、无菌试管等。

【实验步骤】 1．灭活　将装有准备好的小鼠脑脊液试管放入 56℃水浴， 10 min灭活。 2．染色　在洁净载玻片上滴加一滴新型隐球菌液（脑脊液）混匀。 3．镜检　盖上盖玻片，在显微镜下观察，找出隐形菌，并观察荚膜情况。【结果与讨论】 1．新型隐球菌灭活以后荚膜是否存在？ 
2．将显微镜下观察的隐形菌形态按适当比例绘制。

第四部分　综合性实验.85
【实验目的】葡萄球菌是常见的革兰阳性球菌，广泛存在于自然界，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等 35种。金黄色葡萄球菌主要引起局部组织的化脓性感染（如疖、痈和皮下蜂窝织炎）、菌血症、心内膜炎等全身感染等，也可引起骨髓炎、化脓性关节炎、肺炎和深部脓肿等。表皮葡萄球菌偶尔致病，腐生葡萄球菌一般不致病。葡萄球菌属为革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性，多数能分解葡萄糖，产酸不产气，致病性菌株可分解甘露醇。葡萄球菌属内的鉴别可借助血浆凝固酶试验和新生霉素试验，具体鉴别流程如图 4-1-1所示。
图 4-1-1　葡萄球菌鉴别流程【实验设计及流程】 1．实验Ⅰ（1）标本涂片观察。
（2）准备实验Ⅱ：配置酵母胰蛋白胨培养基。 

2．实验Ⅱ（1）利用连续划线法或分区划线法（视标本类型而定），将细菌接种于培养皿上。（2）经过 37℃下培养得到单菌落，菌落观察。在普通平板上呈中等大小、圆形不透明、边缘整齐、表面光滑的菌落，并可产生不同的脂溶性色素，金黄色葡萄球菌为金黄色，表皮葡萄球菌为白色，腐生葡萄球菌为柠檬色。（3）挑取单菌落进行革兰染色。图 4-1-2示教了学生的一次染色结果。
（4）挑取单菌落进行触酶试验（ catalase test）：挑取待检菌落置于洁净载玻片上，滴加 3%过

氧化氢溶液数滴， 1 min内见大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。如图 4-1-3所示。葡萄球菌属能产生过氧化氢酶，试验结果为阳性，而链球菌属呈阴性。该试验可很好区分葡
AB C DE F 图 4-1-2　革兰染色结果示教（彩图附后） A．金黄色葡萄球菌； B．肺炎链球菌； C．大肠杆菌； D．未知菌 S1；E．未知菌 S2；F．牙垢菌群染色 
图 4-1-3　触酶试验结果示教左、右两侧：触酶试验阳性；中间：触酶试验阴性萄球菌和链球菌。注意应取对数生长期的细菌，过氧化氢溶液应新鲜配置。 3．实验Ⅲ　血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验是对葡萄球菌属内鉴定有重要意义的试验。致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种称为结合凝固酶，结合于菌体表面并不释放，直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使其发生沉淀并包围于细菌外面凝聚成块；另一种称为游离凝固酶，可分泌至菌体外，使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固。玻片法可测定结合凝固酶，试管法可同时测定结合和游离凝固酶。玻片法：在洁净载玻片中央用接种环取人或兔新鲜血浆，挑取待检菌落与血浆混合。立即观察结果，出现凝集者为阳性，细菌在血浆中呈均匀浑浊为阴性。试管法：于试管内加入 1∶4稀释的人或兔新鲜血浆 0.5 mL，挑取待检菌落加入试管充分混合，置 37℃水浴， 3～4h后观察结果。如有凝块或整管凝集出现为阳性，血浆不凝固呈流动状为阴性。该试验也可用商品化的试剂盒完成，只需在西林瓶中加入 0.5 mL无菌生理盐水，再加入待测菌液 0.3 mL，37℃孵育 6h观察结果。如图 4-1-4所示，左侧出现凝集，为凝固酶阳性结果，右侧为阴性，液体仍能流动。
图 4-1-4　凝固酶试验结果示教（彩图附后）左侧出现凝集，为凝固酶阳性结果；右侧液体仍能流动，为凝固酶阴性结果金黄色葡萄球菌试验结果为阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌为阴性。 4．实验Ⅳ　新生霉素试验将待检菌均匀涂布在琼脂平板上，用镊子贴上新生霉素药敏纸片，在 37℃下培养 24 h后观察抑菌圈大小。抑菌圈直径 ≤16 mm为耐药，＞16 mm为敏感。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌试验结果为敏感，腐生葡萄球菌为耐药。【实验体会】通过本次实验，应对微生物的鉴定流程产生直观的印象，了解如何通过形态染色、培养特性、生化反应、药敏试验等方法，对葡萄球菌及具体种类进行鉴定。
【实验目的】沙门菌属（ salmonella）是寄生于人和动物肠道的革兰阴性杆菌，属于肠杆菌科，种类繁多。沙门菌属可引起人和动物的败血症与胃肠炎，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的主要病原菌之一。对人具有致病性的主要包括伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌（甲型、乙型、丙型）、鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌。沙门菌为革兰阴性杆菌，主要通过形态特点、培养特性及生化反应进行鉴定，血清凝集试验可以进行分群分型鉴定，肥达试验则常用于伤寒、副伤寒的辅助诊断。沙门菌可分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气），不分解乳糖（除外亚利桑那菌），多数产生 H2S，不产生靛基质（吲哚试验），不分解尿素，不液化明胶，不产生乙酰甲基甲醇（VP试验），多数能利用枸橼酸盐，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。【实验设计及流程】 1．实验Ⅰ（1）标本涂片和革兰染色；染色结果：革兰阴性短杆菌，两端钝圆，无芽孢。
（2）准备实验Ⅱ：配置麦康凯琼脂平板和 SS琼脂平板。 

2．实验Ⅱ（1）利用连续划线法或分区划线法（视标本类型而定），将细菌接种于麦康凯琼脂平板和 SS琼脂平板上，这两种培养基能够提高标本的阳性检出率。对某些特殊样本，需先用肉汤培养基进行增菌。
（2）经过 37℃下培养得到单菌落，菌落观察；由于沙门菌不分解乳糖，在麦康凯琼脂平板上形成无色、半透明、光滑凸起的小菌落。在 SS琼脂平板上，多数菌落可形成无色、半透明、中心黑色或几乎全部黑色（产 H2S）的菌落。
（3）氧化酶试验：挑取可疑单菌落于滤纸上，吸取少量氧化酶试剂滴在菌落上，滤纸变为紫红色为阳性，沙门菌应呈阴性反应。
（4）准备实验Ⅲ：配置三糖铁（ TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基、 MIU（动力 -吲哚 -尿素）培养基（半固体琼脂、蛋白胨水培养基、尿素酶琼脂）。 

3．实验Ⅲ　生化检测。三糖铁琼脂：先在斜面划线，再于底层穿刺，在 37℃下培养 24 h。沙门菌的典型反应：斜面产碱（ K，红色）；底部产酸（ A，黄色）；中部产 H2S（黑色，少数不产）。其原理为 TSI中乳糖∶蔗糖∶葡萄糖比例为 10∶10∶1。一般沙门菌只发酵葡萄糖产酸，底层产酸变黄（处于厌氧条件，酸类不被氧化），斜面先变黄，而后酸被空气氧化，加之细菌利用氨基酸产生碱性物质致使斜面产碱变红。大多数沙门菌产 H2S，遇铁或铅盐产生黑色沉淀。 MIU（动力 -吲哚 -尿素）试验：穿刺接种半固体琼脂培养基，在 37℃下培养 24 h，沙门菌有动力，沿穿刺线浑浊生长。吲哚试验结果不定，尿素酶试验阴性。赖氨酸脱羧酶试验：先穿刺接种底层两次，再在斜面划线，在 37℃下培养 24 h。沙门菌的典型反应：试管底层呈碱性反应（紫色，阳性）。沙门菌使氨基酸脱羧产碱显示为紫色，阴性反应发第四部分　综合性实验.89酵葡萄糖产酸，培养基呈黄色。表 4-2-1列举了三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基上的反应结果与可能菌属。表 4-2-1　三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基筛选
K  A ＋（.） ＋（.） ＋ 可疑沙门菌属  K  A ＋（.） ＋（.） ＋ 可疑沙门菌属  A  A ＋（.） ＋（.） ＋ 可疑沙门菌属  A  A ＋/. ＋/.  . 非沙门菌属  K  K ＋/. ＋/. ＋/. 非沙门菌属 
　　注： K：产碱； A：产酸；＋：阳性； .：阴性；＋（.）：多数阳性，少数阴性；＋/.：阳性或阴性 4．实验Ⅳ　血清学鉴定。伤寒杆菌有三种抗原：分别为菌体抗原（ O抗原）、鞭毛抗原（ H抗原）和体表抗原（ Vi抗原），其中以 O抗原及 H抗原的抗原性较强。对生化鉴定为沙门菌的菌株，需用玻片凝集法进行血清学分型。通常先做菌群分析，再做菌型分析。菌群鉴定主要借助于沙门菌 O抗原多价血清，甲型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌和伤寒沙门菌分别属于 A、B、D血清群。试验方法：在干净的载玻片上，用灭菌好的接种环蘸取两环 O抗原多价血清，取适量的待测菌与之混合，将玻片轻轻摇动 30～60 s，同时设阴性对照，若阴性对照均匀混浊，而待测菌出现肉眼可见的颗粒状凝集物，则为阳性。确定 O群后，分别选择相应的 H因子血清检查第 1相抗原，如为双相菌，在检出第 1相 H抗原后，进一步用复合因子血清检查第 2相 H抗原，如双相菌仅检出其中一相 H抗原时，应用位相诱导法检出另一相 H抗原。后综合 O、H及 Vi因子血清检查的结果判定细菌型别。 5．实验Ⅴ　肥达（ Widal）试验。用已知的伤寒沙门菌 O、H抗原，甲乙丙副伤寒沙门菌 H抗原稀释后与被检血清作定量凝集试验，以检测患者血清中抗体的含量，来判断机体是否受沙门菌感染而导致肠热症并判别沙门菌的种类。实验步骤：（1）取 32支小试管置于试管架上，总共 4排，每排 8支。（2）另取大试管一支，加入患者血清 0.2 mL和生理盐水 3.8 mL，得到 1∶20稀释液，将此稀释血清加入各排管中，每管 0.5 mL（共 4排，总量 2 mL）。
（3）再取 2 mL生理盐水把大试管内剩余 2 mL血清两倍稀释，将此 1∶40稀释血清加入各排第二管中，每管 0.5 mL（共 4排，总量 2 mL）。
（4）以此类推，每排后一管加 0.5 mL生理盐水作阴性对照，则每排各管的稀释度： 1∶20， 1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280。
（5）加入菌液， 4排分别加入伤寒沙门菌 H菌液、伤寒沙门菌 O菌液、甲型副伤寒沙门菌 H菌液和肖氏伤寒沙门菌 H菌液，每管各 0.5 mL。此时各管血清稀释度又增加一倍，分别为 1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280，1∶2560。

（6）充分振荡混匀，于 37℃下放置 24 h判定结果。结果判定：（1）先观察后一管生理盐水对照，对照无凝集时再观察其他各组，否则可能为菌液自凝引起，需重新检测。（2）凝集程度判定：＋＋＋＋：液体清澈透明，菌体全部被凝成块，沉于管底。＋＋＋：液体较透明，大部分菌体被凝集而沉于管底。＋＋：液体稍透明，管底有少量凝集沉淀物。＋：液体较混浊，可见极少量凝集物。 .：液体混浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑圆点（与对照管相似）。

（3）效价判定：以呈现＋＋反应的血清稀释度为终点效价。肥达试验结果判定举例如表 4-2-2所示。

表 4-2-2　肥达试验结果判定举例
【实验体会】和第四部分综合性实验中实验一对应，本章主要展示了一种革兰阴性菌及沙门菌属的鉴定流程。在本章内，主要介绍了一些传统的检测方法，相较于传统的生化检测方法，现在市场上亦有商品化的生化鉴定系统，比如 API 20E。在沙门菌的检测工作中， PCR也可作为初筛手段，针对沙门菌属侵袭性抗原保守基因（ invA基因）设计引物，可以提高效率，降低成本。
5．实验Ⅴ（1）结核杆菌抗酸染色。
（2）金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、未知菌 S1和 S2完成药敏实验。

【实验体会】在实践中，这种贯穿实验极大激发了学生们的兴趣，由于实验是分小组进行，学生们自发地进行全班的信息交流，因为很多组选择的未知菌都是类似的菌，可以从其他组的信息中得到一些启示；对于比较有代表性的未知菌，不同组之间的信息也可以互补印证。有学生提出：这样的实验其实和“内科大查房”非常相似。未知菌像在临床碰到的一个未知的疾病，而每堂课所做的实验就是在进行问诊、检查，然后一起讨论的过程，后所得出的结论就像是病例报告！图 4-3-1是两者的对比图。
图 4-3-1　未知菌鉴定流程和疾病诊断流程对比图
【实验目的】生物芯片（ biochip）技术是把生物医学检测相关的材料，例如核酸、蛋白、细胞、组织等非常微小的材料，有序地固定到芯片上，或者在芯片上制作各种微流体的管道和反应池，用这些器件实现对细胞、蛋白、基因及其他生物成分的快速、并行处理和分析。生物芯片具有高通量、微型化、自动化、高灵敏度和高特异性的特点，已经广泛应用于疾病预测、疾病预防、个体化治疗、药物开发、食品安全、环境检测、农业育种、太空探索、国家安全和司法鉴定等多个领域。生物芯片的分类方法众多，为常用的分类方法是按照结构特点将其分为两类：类是微阵列芯片，包括人们熟知的基因芯片等；第二类为微流控芯片，包括各类样品制备芯片、温控生化反应芯片、毛细管电泳芯片等，其境界是将全部步骤集成在一个器件上，形成微型全分析系统，也叫作“芯片实验室”（lab on a chip）。目前有不少生物芯片已开始应用于感染性疾病的检测。 Cepheid公司所开发出的 GeneXpert Systems系列产品，可以对多种感染性疾病进行快速诊断，其中多项病毒检测指标已获得美国食品药品监督管理局（ Food and Drug Administration，FDA）认证。以 Xpert Xpress Flu/RSV为例，这款产品于 2017年获得 FDA认证，可以鉴定出流感病毒 A（influenza A，Flu A）、Flu B和呼吸合胞病毒（ respiratory syncytial virus，RSV）病毒，耗时仅需 30 min。在国内，博奥生物有限公司研发了一款用于核酸分析的微流控芯片，该芯片使用聚碳酸酯（PC）、聚甲基丙烯酸甲酯（ PMMA）或聚乙烯（ PE）材料芯片，采用微加工和胶粘封装工艺，在一块直径 60.0 mm的芯片上一次可实现一份样品 24个不同指标的检测（图 4-4-1）。
图 4-4-1　微流控芯片结构图示（彩图附后）基于这款芯片所研发的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）可同时对 13种常见病原菌（即肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌）进行非培养的快速并行检测，检测只需要 1h，可很大程度解决目前呼吸道感染病原菌检测周期长、确诊率低、部分细菌难培养等问题，可以很好地辅助临床诊断。该款产品于 2016年获得医疗器械注册证书，已经在北大人民医院、北京协和医院、广州医科大学一附院、浙江大学医学院一附院、福建省立医院等 100多家医院开展应用。和常规 PCR方法相比，等温扩增技术不需要模板的热变性、温度循环，因此具有简单、快速、低成本的特点。 2000年 Notomi等建立了环介导等温扩增技术，该技术依赖于自动循环的链置换反应，在等温条件下，不到 1h就能扩增出 109靶序列复制。本章以上述微流控芯片为例，简要介绍如何在这款芯片上利用等温扩增技术实现对大肠杆菌（ E.coli）的快速检测。【实验设计及流程】 1．步骤一　引物设计。等温扩增技术利用具有链置换活性的 BstDNA聚合酶，通过识别靶序列上 6段特异区域的 4条引物，在恒温条件下催化新链的合成。等温扩增引物的设计主要是针对靶基因的 6个不同区域对应的 6条特异性序列，如图 4-4-2所示。 F2区和 B2c区位于靶序列两端， F1区和 B1c区分别位于 F2区和 B2c区内侧， F3区和 B3c区分别位于 F2区和 B2c区外侧。 4条引物分成一对内部引物和一对外部引物，内部引物包括上游内部引物（ forward inner primer，FIP）和下游内部引物（backward inner primer，BIP），外部引物包括 F3和 B3序列。
图 4-4-2　等温扩增的 6条特异性序列组合结构图示引物的设计可以借助在线设计软件，比如 PrimerExplorer V4（网址： https：//primerexplorer. jp/e等温扩增 4.0.0/index.html）本章为同学们提供大肠杆菌（ E.coli）设计好的引物，如表 4-4-1所示。表 4-4-1　等温扩增引物信息
F3  1  20  20  59.93  .5.75  .4.32  0.5  GGCATCGTGGTGATTGATGA  B3  190  209  20  59.82  .5.79  .5.25  0.5  GGTTCGTTGGCAATACTCCA  FIP  40  TC T T T C G G C T T G T T G C C C G C – CTGCTGTCGGCTTTAACCTC  BIP  42  TA C A GCGA A G AGG CA G TCA A C G – TTTT-GGTTTTTGTCACGCGCTATC  F2  26  45  20  60.38  .5.74  .4.85  0.55  CTGCTGTCGGCTTTAACCTC  F1c  67  86  20  65.82  .3.87  .8.37  0.6  TCTTTCGGCTTGTTGCCCGC  B2  153  172  20  59.36  .4.27  .4.32  0.5  GGTTTTTGTCACGCGCTATC  B1c  91  112  22  64.38  .4.98  .5.35  0.55  TACAGCGAAGAGGCAGTCAACG  LF  46  66  21  57.48  .4.28  .3.1  0.38  TTCGAAACCAATGCCTAAAGA  LB  127  144  18  59.89  .7.58  .5.58  0.56  GCGCACTTACAGGCGATT