中药资源转录组分析操作指南

本书站在学科前沿，以原创的笔触系统介绍了药用植物转录组的理论、技术及研究方法。全书论述了药用植物转录组研究的现状和主要技术方法，并重点探讨了基于同源基因功能分的药用植物活性成分变异机制，以及功能性ＥＳＴ-ＳＳＲ标记的概念、优势、应用范围等；全面介绍了药用植物转录组的操作流程，包括转录组数据的组装、基因克隆及表达分析、数据库使用及生物信息学分析、ＳＳＲ标记开发等；同时，附有药用植物与真菌转录组研究的鲜活参考范例。 

本书主要介绍了分子生药学关键技术方法——重要资源转录组的理论、技术及研究方法。全书分为三篇：篇系统论述了药用植物转录组研究的现状和主要技术方法，并重点探讨了基于同源基因功能分化的药用植物活性成分变异机制，以及功能性EST-SSR标记的概念、优势、应用范围等；第二篇全面介绍了药用植物转录组的操作流程，包括转录组数据的组装、基因克隆及表达分析、数据库使用及生物信息学分析、SSR标记开发等；第三篇主要介绍了药用植物与真菌转录组研究的参考范例。
本书从理论、技术、实际应用的角度全面介绍了药用植物转录组这一关键技术方法，同时提供了可操作性强的实验指导。本书不仅可以作为医药院校生药专业、中医院校中药专业的本科生、研究生及教师的实验教学用书，也可作为相关科研人员的参考书。

黄璐琦，中国工程院院士，中国中医科学院副院长，研究员。国家973计划首席科学家，国家药典委员会委员，国家生物物种保护专家委员会委员，国家中医药管理局中药学学科带头人，主要从事中药资源学和分子生药学的研究。先后负责*和部局级课题20余项。曾获国家科学技术进步二等奖3项，国家中医药管理局二等奖2项、三等奖1项，北京市科技进步二等奖2项。

篇理 论 篇

一、 中药资源转录组概述3
（一） 转录组的研究目标3
（二）  转录组的研究方法5
（三）  中药资源转录组研究现状5
（四） 中药资源转录组研究展望12
二、 同源基因功能分化与活性成分变异机制22
（一） 同源基因的正确注释是研究药用植物活性成分
变异的重要前提22
（二） 重复基因的功能分化是形成药用植物活性成分
变异的基础24
（三） 药用植物基因功能分化决定其活性成分的变异26
三、 功能性ESTSSR标记31
（一） 功能性ESTSSR的基本概念31
（二） 功能性ESTSSR的开发流程32
（三） 功能ESTSSR的优势35
（四） 功能性ESTSSR标记在中药资源中的应用36
（五） 药用植物功能性ESTSSR标记展望38
〖〗第二篇技 术 篇

一、 转录组数据的组装43
实验一样品收集与保存43
实验二RNA提取44
实验三mRNA分离纯化47
实验四Solexa文库制备49
实验五上机测序53
实验六转录组数据组装59
实验七转录组数据功能注释61
二、 基因克隆及表达分析64
实验八基因克隆64
实验九基因表达分析71
实验十共表达分析80
三、 数据库使用及生物信息学分析84
实验十一核酸数据库及其使用84
实验十二蛋白质数据库及其使用91
实验十三代谢数据库及其使用96
实验十四文献数据库及其使用101
实验十五NCBI序列数据的提交104
实验十六多序列对位排列分析109
实验十七系统发育分析112
实验十八核酸序列的分析和转换117
实验十九基因开放阅读框预测123
实验二十蛋白质理化性质预测129
实验二十一蛋白质亚细胞定位信号预测130
实验二十二蛋白质信号肽和跨膜结构域预测132
实验二十三蛋白质二级结构和三级结构预测135
四、 SSR标记开发139
实验二十四SSR位点开发139
实验二十五SSR引物设计140
实验二十六基因组DNA提取143
实验二十七琼脂糖凝胶电泳145
实验二十八非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳147
实验二十九SSR数据统计149
实验三十SSR数据分析155
〖〗第三篇实 践 篇

一、 金银花转录组与质量评价标记筛选161
二、 地黄根部转录组文库的构建及响应连作障碍关键基因的
筛选174
三、 比较转录组学和代谢组学相结合研究丹参酮生物合成分
子机制186
四、 罗汉果果实转录组测序的研究209
五、 基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对甘草根基因表达的
调控222
六、 基于黄芩cDNA文库的功能ESTSSR标记开发236
七、 茯苓转录组SSR序列特征及其功能预测255
八、　川西獐牙菜（藏茵陈）转录组SSR信息分析268
九、 厚朴MVA途径相关基因鉴定及生物信息学分析288
十、 三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析301

〖〗前言〖〗FOREWORD〖〗〖〗前言基因资源作为中药资源的重要组成，已逐渐成为行业研究关注的热点。在后基因组时代，转录组学作为活跃学科之一，其为基因表达、结构和功能研究提供了技术手段，是保障中药产业现在及未来可持续发展的关键因素之一。
广义的转录组是指生物体细胞或组织在特定状态下所转录出来的所有RNA的总和。通过转录组分析，不但可以高通量地获得基因表达的RNA水平有关信息，而且可以揭示基因表达与生命现象之间的内在联系，从而表征生命体生理活动规律，确定其代谢特性。由于不同生长时间和生长环境下，同一生物体中基因表达情况并不完全相同，进行多器官、多时期、多维度、多水平的中药资源转录组研究，建立中药资源功能基因库，可为中药资源种质资源评价、新品种选育、中药材质量控制、活性成分的合成生物学等领域提供分子基础，从而推动中药产业的可持续发展。具体来说，通过转录组可以对药用动植物基因转录的情况，不同个体之间的SNP差异、基因拷贝数差异、基因进化、次生代谢合成与调控、药材性状相关分子标记开发等进行研究，其目标包括基因功能注释，检测新的转录本、基因转录水平、非编码区域（ncRNA）功能、转录本结构变异，SSR和SNPs标记开发等。
2009—2014年，黄花蒿、丹参、西洋参、淫羊藿、蝎子、大麻、紫杉、狼毒、罗汉果、南方红豆杉、三七、柴胡、水蛭、虎杖、大蒜、贯叶连翘、红花、胡黄连、沙冬青、何首乌、白木香、金银花、牡丹、蛹虫草、灵芝、贯叶连翘、红花、沙棘、中华鳖、地黄、毛地黄、土鳖虫、酸浆果、牡丹、黄花蒿、乌拉尔甘草、长春花、沙棘、枸杞、萝卜、茯苓、西洋参、冬瓜、魔芋、博落回、七叶一枝花、铁皮石斛、人参、积雪草、冬虫夏草、鱼腥草等药用植物均已通过RNAseq进行了转录组研究，证明RNAseq在发现药用动植物转录组基因和遗传标记中非常有效。
另一方面，完成转录组测序仅是功能基因组研究的步，更大的挑战在于搞清基因序列的遗传信息与其所执行的生物学功能，对直向同源基因和共生同源基因进行正确的功能注释，建立中药资源基因数据库。在基因进化理论和方法的指导下，对药用动植物重复基因功能分化进行分析，并与活性成分种类和数量变化相结合，从分子生药学角度揭示药用动植物物种、部位、产地间活性成分差异的机制，为指导药材质量控制提供理论依据。
本书是继《中药分子鉴定操作指南》后推出的分子生药学系列第二本实验操作指南，主要包括4个部分： 部分为转录组数据的组装，主要介绍如何获得基因数据，涉及7个实验操作规程，如样品收集和保存（实验一）、RNA提取（实验二）、mRNA分离纯化（实验三）、Solexa文库制备（实验四）、上机测序（实验五）、转录组数据组装（实验六）、转录组数据功能注释（实验七）；第二部分为基因克隆及表达分析，主要介绍如何筛选与目的性状相关的候选基因，涉及3个实验操作规程，如基因克隆（实验八）、基因表达分析（实验九）、共表达分析（实验十）；第三部分为数据库使用及生物信息学分析，主要介绍利用生物信息学手段对候选基因的结构和特征进行预测，涉及核酸数据库（实验十一）、蛋白质数据库（实验十二）、代谢数据库（实验十三）、文献数据库（实验十四）及其使用，以及9个实验操作规程，如NCBI序列数据的提交（实验十五）、多序列对位排列分析（实验十六）、系统发育分析（实验十七）、核酸序列分析和转换（实验十八）、基因开放阅读框预测（实验十九）、蛋白质理化性质预测（实验二十）、蛋白质亚细胞定位信号预测（实验二十一）、蛋白质信号肽和跨膜结构域预测（实验二十二）、蛋白质二级结构和三级结构预测（实验二十三）；第四部分为SSR标记开发，涉及7个实验操作规程，如SSR位点开发（实验二十四）、SSR引物设计（实验二十五）、基因组DNA提取（实验二十六）、琼脂糖凝胶电泳（实验二十七）、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（实验二十八）、SSR数据统计（实验二十九）、SSR数据分析（实验三十）。此外，本书还介绍了药用植物和真菌转录组研究方面的实例。
希冀本书的出版，能为从事中药学研究的科研人员和在校师生提供参考