基因工程——动物细胞制药关键技术

1.本书反映了近十年来基因工程的新进展2.本书汇聚了基因工程的成果与技术3.内容全面、实用性强，基因工程研究领域必看

《基因工程——动物细胞制药关键技术》围绕动物细胞表达系统生产重组蛋白质药物的关键技术，从动物细胞培养、动物细胞载体、目的基因导入、重组稳定细胞株筛选和评估、重组蛋白分离纯化、重组蛋白药物鉴定与分析、重组蛋白药物新技术等方面，详细介绍了该领域的关键技术及新技术。本书涵盖了动物细胞制药基因工程近年来的最新的关键技术及相关进展，可作为从事生物制药、基因工程等领域工作的科研人员、专业技术人员及相关专业的教师和学生的参考用书。

王天云，博士，教授，博士生导师。新乡医学院“太行学者”特聘教授。河南省重组药物蛋白表达系统国际联合实验室及生物创新药物工程技术研究中心主任，中国生物化学与分子生物学会理事，河南省生物化学与分子生物学会理事长，“长江学者”，国家科技进步奖评审专家。主持国家自然科学基金4项，省重大科技专项1项，创新杰出人才项目1项；参与国家“863”课题、国家重大科技专项各1项。获省科技进步二等奖2项、三等奖1项。申请国家发明专利35项，已授权16项。发表研究论文86篇，其中SCI收录53篇，被引1076次。长期从事哺乳动物细胞表达系统的研究，建立了国际水平的哺乳细胞表达系统，包括高效表达载体、细胞系及培养基。已实现技术转移2项，专利转化8项。

第一章  动物细胞培养      001
第一节  动物细胞培养基础知识    002
一、基本概念    002
二、动物细胞培养条件    003
三、动物细胞培养实验室    004
四、无菌技术    006
第二节  动物细胞培养技术    007
一、动物细胞冻存与复苏    007
二、动物细胞传代    009
三、动物细胞悬浮驯化及无血清培养    011
四、动物细胞分批培养    015
五、动物细胞补料分批培养    016
六、动物细胞灌流技术培养    022
第三节  动物细胞生物特性分析    025
一、动物细胞生长曲线和倍增时间分析    025
二、动物细胞增殖测定    028
三、动物细胞凋亡检测    031
四、动物细胞周期检测    036
参考文献    038

第二章  动物细胞载体    041
第一节  质粒载体构建    042
一、目的基因获取    042
二、限制性内切酶酶切    046
三、目的片段和载体连接    048
四、重组子转化    050
五、重组载体筛选    052
六、重组载体鉴定    052
第二节  病毒载体构建    056
一、杆状病毒表达载体    056
二、慢病毒载体    057
三、腺病毒载体    059
四、逆转录病毒载体    060
参考文献    061

第三章  目的基因导入    065
第一节  动物细胞转染    066
一、脂质体转染    066
二、聚乙烯亚胺转染    067
三、电穿孔转染    068
四、影响细胞转染的因素    069
第二节  细胞转染效率检测    070
一、流式细胞仪检测    071
二、荧光显微镜检测    071
参考文献    072

第四章  重组稳定细胞株筛选和评估    075
第一节  重组稳定细胞池筛选    076
一、常用的抗生素筛选标记    076
二、遗传霉素筛选    078
三、DHFR筛选    079
四、GS筛选    080
第二节  重组单克隆细胞株分离    081
一、有限稀释法    081
二、流式细胞荧光分选技术    082
三、ClonePix    083
四、克隆环法    084
五、其他筛选方法    085
第三节  重组稳定细胞系评估    086
一、细胞污染检测    086
二、细胞系鉴定    087
三、外源基因整合分析    089
四、重组蛋白表达分析    098
参考文献    101

第五章  重组蛋白分离纯化     103
第一节  重组蛋白纯化策略及设备    104
一、重组蛋白纯化策略    104
二、重组蛋白纯化设备    107
第二节  重组蛋白沉淀和膜分离技术    116
一、蛋白质沉淀法    117
二、膜分离技术    118
第三节  重组蛋白分离色谱技术    119
一、亲和色谱法    120
二、疏水色谱法    122
三、凝胶过滤色谱法    124
四、离子交换色谱法    126
五、反相色谱法    129
参考文献    131

第六章  重组蛋白药物鉴定与分析     135
第一节  蛋白质理化特性    136
一、分子量测定    136
二、等电点与电荷异质性分析    141
三、肽图分析    144
四、氨基酸组成分析    145
五、N端氨基酸测序    150
六、C端氨基酸测序    152
七、二硫键分析    153
八、高级结构分析    155
第二节  蛋白质含量分析    159
一、凯氏定氮法    159
二、Lowry法    161
三、BCA法    162
四、Bradford法    164
五、紫外吸收法    166
六、高效液相色谱法    166
第三节  蛋白质纯度分析    168
一、宿主细胞蛋白残留分析    168
二、宿主细胞DNA残留分析    170
三、残留抗生素检测    172
四、其他成分检测    173
第四节  糖基化修饰分析    181
一、分离富集亲和技术    182
二、糖蛋白鉴定/糖基化位点的确定方法    187
三、糖链结构分析    189
第五节  生物学活性测定    206
一、体外法评估    207
二、体内法评估    211
第六节  免疫化学特性分析    213
一、亲和力测定    213
二、抗原结合表位测定    217
参考文献    219

第七章  重组蛋白药物新技术      223
第一节  人工智能与蛋白药物设计    224
一、核苷酸及蛋白质相关数据库    224
二、基因信息分析及密码子优化    226
三、蛋白质信息分析及结构预测    241
四、人工智能设计    255
第二节  miRNA筛选与应用    269
一、miRNA筛选    269
二、miRNA应用    273
第三节  基因编辑技术    279
一、动物细胞CRISPR基因敲除    279
二、动物细胞基因敲入    289
第四节  表观遗传学技术    299
一、DNA甲基化分析    299
二、组蛋白修饰分析    305
三、非编码RNA分析    314
第五节  DNA与蛋白质相互作用分析    323
一、凝胶迁移实验    323
二、DNaseⅠ足迹实验    330
三、酵母单杂交系统    337
四、染色质免疫沉淀    351
五、噬菌体展示技术（DNA与蛋白质相互作用）    354
参考文献    356

附录1  常用缓冲液及试剂的配制    363

附录2  中英文词汇表    369

1972年首次成功在体外完成DNA分子的重组改造，标志着基因工程技术的诞生。目前，基因工程技术已广泛应用在药物研发和生产领域，尤其是利用动物细胞生产重组蛋白药物已成为现代生物制药中最常用的技术手段之一。
相比细菌、酵母等表达系统，动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质正确折叠，提供复杂的糖基化修饰等翻译后加工等。目前批准上市的近 80%的重组蛋白药物来源于动物细胞表达系统。近30年来特别是近10年来，科研工作者围绕动物细胞表达系统做了大量卓有成效的工作，重组蛋白药物的产量和质量都有很大提高。国内的企业和科研机构主要参考国外相关实验指导及自己建立的重组蛋白药物研发流程进行实验设计和实施，尚无一本动物细胞基因工程生产重组蛋白药物技术方面的专著。
鉴于以上原因，在长期的科研活动中，我们不断总结经验，交流学习，在查阅国内外大量相关文献的基础上，结合自己的实践，编著了这本《基因工程——动物细胞制药关键技术》。全书共分七个章节，包括动物细胞培养、动物细胞载体、目的基因导入、重组稳定细胞株筛选和评估、重组蛋白分离纯化、重组蛋白药物鉴定与分析、重组蛋白药物新技术等内容。
本书可作为从事生物制药方向的研究人员及研究生的指导用书，也可以作为药学等相关专业本科生的实验指导教材。参加本书撰写的人员主要来自河南省重组药物蛋白表达系统国际联合实验室、新乡医学院、抗体药物与靶向治疗国家重点实验室、国家药品监督管理局治疗类单抗质量控制重点实验室及华兰基因工程有限公司的科研及生产工作一线人员。他们具有多年丰富的重组蛋白药物研发、药物质量控制等方面经验，为本书的编写投入了大量的精力。另外，化学工业出版社编辑在本书的编辑加工中做了大量细致的工作，在此对他们表示衷心的感谢！
因著者水平有限，加之日常繁重的教学、科研等各种工作，尽管每位著者都付出了辛勤的劳动，仍不免出现疏漏和不足，敬请各位读者提出宝贵意见，以便再版时改正！

著者
2023年1月